162 Control de Calidad en Laboratorio Clnico

Prctica # 5. Verificacin de la linealidad fotomtrica

Espectrofotmetro utilizado: 1C Coleman Objetivo: Verificar si existe relacin lineal entre la respuesta luminosa obtenida en un espectrofotmetro y la concentracin utilizando altas concentraciones de un cromforo estable. Calcular el error debido a la falta de linealidad fotomtrica. Fundamento: La mayora de las mediciones que se realizan actualmente, en los laboratorios clnicos son fotomtricas, de ah que la calidad analtica dependa entre otras cosas, del tipo y estado en que se encuentre el instrumento utilizado. Si en los laboratorios se utilizan espectrofotmetros con deficiencias en su calibracin de la longitud de onda y/o sensibilidad, entonces esto ocasionar problemas de exactitud. Es por eso que se han desarrollado varios mtodos para verificar la linealidad en los fotmetros. Las determinaciones fotomtricas dependen de que la magnitud de la absorbencia (A) sea directamente proporcional a la concentracin (C) del compuesto a medir, siendo necesario construir una curva tipo o curva de calibracin, que presente grficamente la relacin existente entre ambos parmetros. Las concentraciones de los problemas se obtendrn por procedimientos que dependen del tipo de relacin obtenida: a) Si es lineal y parte de cero, se determinar el factor de calibracin qumica (se le llama as para distinguirlo de la calibracin instrumental), que es el inverso de la pendiente de la recta, que a su vez es una constante y se denomina absortividad; al multiplicar el factor por las absorbencias de los problemas se obtienen las concentraciones buscadas. b) Si es una recta que no parte de cero, entonces las concentraciones buscadas se calcularn por regresin lineal. c) Si la relacin no es lineal, se debern aplicar otros modelos matemticos o en su defecto, interpolar en la grfica correspondiente para obtener los resultados buscados. La linealidad fotomtrica es una propiedad que permite conocer el rango de absorbancias dentro del cual el espectrofotmetro produce respuestas proporcionales a los cambios de concentracin de una sustancia. Para esta experiencia, se prepararon diluciones seriadas de dicromato de potasio en agua destilada, la cual es una sustancia que se conoce sigue la ley de Lambert-Beer y por tanto tiene un comportamiento lineal. Se midieron los valores de absorbancia de dichas diluciones a 500 nm, para evaluar el comportamiento del instrumento. Fecha de realizacin: 27/Mar/2012

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Prcticas de laboratorio 163

Procedimiento: Material necesario para cada equipo: Gradilla con 12 tubos; 2 pipetas de 1 ml, 2 de 5 ml y 2 de 10 ml; Espectrofotmetros y cubetas. Agua destilada 100 ml Solucin madre: Dicromato de potasio 530 mg/dL, preparar 12 diluciones mezclando con agua hasta un volumen de 5 ml las siguientes cantidades de Dicromato: (30 ml Dicromato/equipo; 35 ml agua) Tubo # Dicromato (ml) Agua (ml) Factor de dilucin Abs. obtenida Abs. calculada 1 0.1 4.9 50 2 0.2 4.8 3 0.5 4.5 4 1 4 5 1.5 3.5 3.33 6 2 3 2.5 7 2.5 2.5 2.0 8 3 2 9 3.5 1.5 10 4 1 11 4.5 0.5 12 5 0

25.0 10.0 5.0

1.67 1.43 1.25 1.11 1.0

0.05 0.09 0.21 0.40 0.54 0.71 0.83 0.94 1.03 1.03 1.15 1.26 0.03 0.05 0.13 0.25 0.37 0.50 0.63 0.75 0.88 1.00 1.13 1.26 53 106 159 146 212 192 265 224 318 253 371 277 424 278 477 530 308 339

[ ] K2Cr2O7 Terica 10.6 21.2 [ ] K2Cr2O7 Obtenida

13.5 23.4 56.2 106

27% 10% 6% 0% -8% -9% -15% -20% -25% -34% -35% -36% % Error relativo Leer a 500 nm ajustando a cero con blanco de agua destilada

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164 Control de Calidad en Laboratorio Clnico

1. Construya una grfica de correlacin concentracin de Dicromato (terica) en eje x vs Absorbancia obtenida en eje y. Calcule coeficiente de correlacin r, pendiente e interseccin. Coeficiente de correlacin r 0.98 Pendiente 0.62 Interseccin 32.8
y = 0.6183x + 32.829 R = 0.9648

400 350 300 [ ] K2Cr2O7 Obtenida 250 200 150 100 50 0 0 100

Grfic a1

200

300 [ ] K2Cr2O7 Terica

400

500

600

2. Calcule la absorbancia ideal dividiendo la absorbancia de la solucin sin diluir (tubo 12) entre el factor de dilucin (para cada tubo) y trcela en la grfica anterior. Compare la diferencia entre la absorbancia experimental y la ideal.

1.6

Grfic a2

y = 0.9694x + 0.1228 R = 0.9644

1.4 1.2 Abs. obtenida 1

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 Abs. 0.8 1 1.2 1.4

Ideal CCLC/hlz

Prcticas de laboratorio 165

3. Calcule un factor de calibracin dividiendo la concentracin del tubo 4 entre su Absorbancia. 4. Calcule la concentracin de K2Cr2O7 obtenida multiplicando la lectura de Absorbancia de cada tubo por el factor de calibracin.
40% 30% 20%

y = -0.0011x + 0.1448 R = 0.9327

10%

% Error relativo

0% 0 100 200 300 400 500 600

-10%

-20% -30% -40% -50%

[ ] K2Cr2O7 Terica

5.

Compare las concentraciones de K2Cr2O7 reales con las obtenidas y calcule el porcentaje de error relativo. Mediante una grfica represente el error relativo (% de error + o -, en eje Y) del fotmetro relacionndolo con la concentracin terica (eje X).

6. Comente los resultados de la prctica. Hay que tener en cuenta que la LINEALIDAD es el intervalo de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin. De acuerdo a las graficas anteriores, cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los lmites de linealidad se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno, por lo que hay que diluir la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad. El % de error fue mayor fue grande en el extremo de muy baja concentracin y en los ltimos 3 de ms alta concentracin. Este tipo de anlisis nos permiti evaluar el funcionamiento de los espectros habindose observado que es necesario realizar el mantenimiento permanente de los mismos para garantizar la confiabilidad de los equipos, pues la falta de linealidad fotomtrica es el error ms frecuente.

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BIBLIOGRAFA CONSULTADA: 1. Control de calidad de instrumentos y equipamientos de laboratorio: Control de Calidad en los 2. 3. 4. 5.
Laboratorios Clnicos, Cap. 11. Murali Dharan. Control de calidad en espectrofotometra UV-Vis: Fernandez Spina, .,Candau Garca, R. Practical Spectrophotometric Standards: Rand, R.N. Clin. Chem. 1969; 15(9); 839-63. Calibration and Monitoring of Spectrometers and Spectrophotometers: Clin. Chem. 25/6, 1013-1017 (1979) Some Sources of Errors and Artifacts in Spectrophotometric Measurements: Ellis, K., Morrison, J. Clin. Chem. 21/6, 776-777 (1976).