PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR ESCUELA DE BIOANLISIS BIOQUMICA CLNICA MICROBIOLOGA (L) INTEGRANTES: - Jorge Andes Espinoza

-Jorge Moya Blondet -Adrin Cajas CURSO: 1 FECHA: 17/09/2012 TEMA: Informe de Bioqumicas Microbiolgicas

OBSERVACIONES o Proteus Mirabilis Resultado (coloracin) Rojo-Alcalino K/K azul Amarillo ligero verde Sin anillo Azul Fucsia Rojo Rojo-amarillento Porcentaje 96% 75% 0% 98% 2% 92% 98% 97% 50%

Cultivo TSI Citrato Lisina fenilalanina SIM Malonato Urea RM (caldo) VP (caldo)

CONSULTA 1. De cada medio de cultivo utilizado consultar: el fundamento, composicin, preparacin, control de calidad.

TSI Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el 3+ sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Composicin Frmula (en gramos por litro)

Extracto de carne Pluripeptona Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Agar pH final: 7.3 0.2 Preparacin. Calidad Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-134-05

3.0 20.0 5.0 10.0 10.0 1.0 0.2 0.2 0.025 13.0

Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

x 500g :Cdigo: B02-134-06

CITRATO Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa. Fundamento En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad.

Preparacin. Frmula (en gramos por litro) Citrato de sodio Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Fosfato monoamnico Sulfato de magnesio Azul de bromotimol Agar pH final: 6.9 0.2

2.0 5.0 1.0 1.0 0.2 0.08 15.0

Composicin Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 min. y mezclar calentando a ebullicin durante 2 min. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar en posicin inclinada.

Calidad Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-132-05

x 500g :Cdigo: B02-132-06

LISINA Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Composicin Frmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina Extracto de levadura Glucosa Lisina Citrato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar pH final: 6.7 0.2

5.0 3.0 1.0 10.0 0.5 0.04 0.02 15.0

Preparacin. Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin.

Calidad

Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

Presentacin x 100g :Cdigo: B02-106-05 SIM

x 500g :Cdigo: B02-106-06

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2

Composicin. Frmula (en gramos por litro) Triptena Peptona Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar pH final: 7.3 0.2

20.0 6.1 0.2 0.2 3.5

Preparacin Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemlisis y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posicin vertical.

Calidad Medio deshidratado: Medio preparado: a 2-8 C. a 10-35 C.

Presentacin x 100g :Cdigo: B02-131-05 MALONATO

x 500g :Cdigo: B02-131-06

El caldo con malonato se emplea para diferenciar enterobacterias del grupo de Enterobacter de bacterias del grupo de Escherichia; los primeros son capaces de utilizar malonato como nica fuente de carbono, produciendo una reaccin alcalina y cambio de color del medio al azul. Composicin Sulfato amnico, 2g Dihidrgeno fosfato de potasio, 0.4g Hidrgeno fosfato de dipotasio, 0.6g

Cloruro sdico, 2g Malonato sdico, 3g Azul de bromotimol, 0.025g

Preparacin. Disolver todos los componentes en un bao de agua caliente y ajustar el pH a 7. Dispensar en tubos y autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar los tubos en pendiente.

UREA Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos. Fundamento En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. Preparacin. Frmula (en gramos por litro) Triptena Glucosa Cloruro de sodio Fosfato monopotsico Rojo de fenol Agar pH final: 6.8 0.2 Composicin Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 50C y agregar 50 ml de una solucin de urea al 40% previamente esterilizada por filtracin o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemlisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo.

1.0 1.0 5.0 2.0 0.012 15.0

Calidad Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-109-05

x 500g :Cdigo: B02-109-06

FENILANINA El Agar Fenilalanina es utilizado para la diferenciacin de especies de Proteus y Providencia de otras enterobacterias, en base a su capacidad de desaminar la fenilalanina Fundamento Proteus y Providencia de otras enterobacterias en base a su capacidad enzimtica para efectuar la

En este medio la DL-Fenilalanina sirve como sustrato para su desaminacin a cido fenilpirvico. Despus de la incubacin el cido fenilpirvico es detectado con la adicin de cloruro frrico. Los iones frricos forman un quelato con el cido fenilpirvico dando un color verde. El extracto de levadura proporciona las vitaminas y cofactores as como la fuente de carbono y nitrgeno. El difosfato de sodio acta como buffer. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar es adicionado como agente solidificante

Composicin DL- Fenilalanina 2.0 Fosfato de Sodio 1.0 Extracto de Levadura 3.0 Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriolgico 12.0 pH 7.3 0.2

Preparacin.

Mtodo: Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin inclinada.

Procedimiento: Inocular la superficie del medio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al observar desarrollo, adicionar de 3 a 4 gotas del reactivo de cloruro frrico. Observar el desarrollo de color en 1 a 5 minutos. Un color verde indica una reaccin positiva

Calidad Una reaccin positiva se observa por el desarrollo de un color verde. En una reaccin negativa no hay cambio de color del medio. Almacenamiento: 2-30 C. Caducidad: 3 aos en frasco cerrado. Presentacin: Frasco con 450 g Caja con 20 sobres para un litro Medio preparado en caja con 10 Tubos

MR-VP (CALDO) El Medio MR-VP es utilizado para la diferenciacin de organismos coliformes en base a las pruebas de Rojo demetilo y Voges-.Proskauer. Este medio tambin es conocido como Rojo de Metilo VogesProskauer

Fundamento. Cuando se probaron con el Rojo de Metilo como indicador de pH, el grupo de coliformes produca una gran cantidad de cido mientras que el grupo de los aerogenos produca una reaccin menos cida. La prueba para detectar a los altos productores de cido es conocida como Rojo de Metilo (MR).

La prueba para detectar a los menos productores de cido est basada en el procedimiento que describieron Voges y Proskauer en 1898 donde se presenta una reaccin colorida cuando los cultivos se incuban en un medio conteniendo dextrosa y peptona y se les adiciona hidrxido de potasio exponindolos al aire. Esta reaccin pone de manifiesto la formacin de acetilmetilcarbinol y es conocida como la prueba de Voges-Proskauer (VP). En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrgeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el fosfato acta como buffer.

Composicin Mezcla de Peptonas 7.0 Dextrosa 5.0 Fosfato de Potasio 5.0 pH 6.9 0.2

Preparacin. Mtodo: Suspender 17 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 118-121C (no mas de15 libras de presin) durante 15 minutos. Procedimiento: Inocular el medio a partir de una colonia aislada. Incubar a 352C durante 48 horas. Para realizar la prueba RM, transferir 2.5 ml del medio a un tubo de 13x100mL y adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo. Observar la formacin de color. Para la prueba VP, transferir 2.5mL del medio a un tubo de 13x100mL, adicionar 6 gotas del reactivo de alfa-naftol al 5% y 2 gotas del reactivo de KOH al 40%. Agitar y dejar reposar por 10 minutos. Observar el cambio de color

Calidad Prueba Reaccin positiva Reaccin negativa M R Color rojo brillante No hay desarrollo de color V P Color Rojo El medio no cambia de color Almacenamiento: 2-30C. Caducidad: 4 aos en frasco cerrado. Presentacin: Frasco con 450 g Sobre para un Litro

Conclusiones

recomendaciones

Se recomienda verificar en varias tablas para estar seguros del porcentaje En los medios de cultivo enriquecidos como el agar sangre crecen todo tipo de bacterias y la mayora son gramm positivos. Se determin que el agar nutritivo es bueno para el cultivo de grmenes que no presentan exigencias particulares y no es diferencial.

Se determin que el medio de lisina tiene como caracterstica principal diferenciar microorganismos ya que contiene cido sulfrico Determin que los caldos nos ayudan a reconocer grupos coliformes

Se concluy que la fenilamina en Una reaccin positiva se observa un color verde oscuro La urea tiene una encima denominada ureasa la cual hace reaccionar para positivo un color fucsia intenso

Referencias Bibliogrficas

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