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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALTICO POTENCIA MICROBIOLGICA AMPICILINA

MODULO DESARROLLO ANALTICO

NOMBRE DEL PROYECTO POTENCIA MICROBIOLGICA AMPICILINA

NOMBRE DEL ASESOR M. en F. IDALIA L. FLORES GMEZ INTEGRANTES DEL EQUIPO: AGUILAR LPEZ ARISTTELES ROSALES TLLEZ ANA LIZBETH URBINA SOTO JONATHAN URIEL EQUIPO: 15 GRUPO 1801 SEMESTRE: 2013 - 1

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I.FUNDAMENTOS. POTENCIA MICROBIOLGICA La potencia o actividad de los antibiticos se calcula comparando el grado de inhibicin de microrganismos sensibles y especficos, producida por concentraciones conocidas del antibitico analizado y una sustancia de referencia. Las sustancias de referencia empleadas en los ensayos, son sustancias cuya actividad se ha definido por un organismo internacional. En los antibiticos puede haber ligeros cambios qumicos que se traducen en prdida de actividad antimicrobiana que no pueden demostrarse por mtodos qumicos, por sta razn, en caso de duda respecto a la actividad de un antibitico, los mtodos de valoracin microbiolgica prevalecen sobre los mtodos qumicos. Sustancias que se pueden cuantificar a travs del ensayo microbiolgico son los antibiticos y vitaminas. Para valorar microbiolgicamente un antibitico, se pueden emplear dos mtodos: Mtodo cilindro-placa (mtodo de difusin en agar) y Mtodo turbidimtrico, ambos comparan la respuesta del microrganismo de prueba, frente a una Sustancia de referencia (SRef) de actividad conocida y una muestra, tratadas en las mismas condiciones. Mtodo turbidimtrico. Se basa en medir espectrofotomtricamente el crecimiento del microrganismo de prueba en un medio de cultivo lquido que permite su rpido crecimiento y en el que al adicionar crecientes del antibitico se inhibe el crecimiento de forma proporcional a la concentracin adicionada. Mtodo de cilindro en placa (difusin en agar). Se basa en la difusin del antibitico desde un cilindro vertical, a travs de una superficie con agar inoculado con el microrganismo de prueba. La difusin origina zonas de inhibicin del microrganismo cuyo tamao (dimetro) est en relacin con la concentracin del antibitico. Ley de Fick La ley de Fick es una ley cuantitativa en forma de ecuacin diferencial que describe diversos casos de difusin de materia o energa en un medio en el que inicialmente no existe equilibrio qumico o trmico. En situaciones en las que existen gradientes de concentracin de una sustancia, o de temperatura, se produce un flujo de partculas o de calor que tiende a homogeneizar la disolucin y uniformizar la concentracin o la temperatura. El flujo homogeneizador es una consecuencia estadstica del movimiento azaroso de las partculas que da lugar al segundo principio de la termodinmica,

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conocido tambin como movimiento trmico casual de las partculas. As los procesos fsicos de difusin pueden ser vistos como procesos fsicos o termodinmicos irreversibles. La Ley de Difusin de Fick toma en cuenta ciertos criterios para determinar que tan fcil es que difunda una sustancia dada dependiendo de las siguientes caractersticas: Magnitud de gradiente, rea de superficie, Liposolubilidad de la sustancia (entre ms liposoluble, ms rpido difunde), Peso molecular (entre menos peso, pasa ms rpido) - Distancia de difusin J= Flujo neto de material (gramos o moles que cruzan en cm en un segundo) dc/dr= gradiente de concentraciones D= Parmetro molecular denominado coeficiente de difusin EL signo (-) corresponde al hecho de que el flujo neto es siempre en oposicin Antibitico Los antibiticos son compuestos relativamente sencillos, producidos por bacterias u hongos que atacan especficamente a las bacterias. Interfieren en algn paso del metabolismo donde encuentran un blanco adecuado. Desde el descubrimiento de la penicilina, se han descubierto una docena de nuevos tipos de antibiticos y optimizado o sintetizado cerca de una centena. Sin embargo, su eficacia se ha visto alterada por su uso excesivo o incorrecto, que conduce a la aparicin y diseminacin de bacterias resistentes. Estas bacterias resistentes actan impidiendo el ingreso, modificando o inactivando la droga, modificando al blanco, o inactivando a los sistemas de flujo. La gran capacidad de las bacterias de mutar y transferir genes, y la presencia de genes resistencia esencialmente en plsmidos y transposones, contribuyen a su diseminacin tanto entre bacterias emparentadas y/o patgenas como hacia bacterias no patgenas que son los reservorios de bacterias ms resistentes. La sensacin de haber perdido la batalla o de que las ganancias a futuro no son tan importantes, han disminuido el inters de los laboratorios farmacuticos por buscar nuevos compuestos. Sin embargo desde la investigacin bsica aparecen nuevas alternativas ya sea utilizando la genmica como material de anlisis de nuevos blancos, las defensas naturales del organismo husped, u otros agentes olvidados como las bacterias predadoras y los fagos, ambos capaces de destruir bacterias. Ampicilina Existen tres tipos de ampicilinas: La ampicilina sdica, ampicilina potsica y ampicilina trihidratada. La ampicilina es un antibitico penicilinico semisinttico, de amplio espectro y activo por va oral. Aunque es ms activos no es estable frente a las -lactamasas producidas por bacterias gram positivas o gram negativas. La ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a rganos susceptibles como la otitis media, la sinusitis y la cistitis. Debido al aumento de resistencias ya no se recomienda para el tratamiento de la gonorrea.

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Curva de Crecimiento Bacteriano El trmino crecimiento bacteriano se refiere a cambios en la cosecha de clulas (aumento en la masa total de clulas) ms que a cambios en un organismo individual. El crecimiento denota el incremento del nmero o de la masa por encima del inculo original. El tiempo de generacin es el intervalo de tiempo requerido para que la clula bacteriana se divida o para que la poblacin se duplique. Este tiempo es especfico para la batera y de la idoneidad en nutrientes que hay en el medio y de las condiciones fisicoqumicas. Fases del crecimiento bacteriano

Fase LAG (Latencia) No hay un aumento en la poblacin. Las clulas sufren cambios en su composicin qumica. Fase LOG (logartmica o exponencial) Las clulas se duplican o se dividen a un ritmo constante. La masa se duplica al mismo ritmo. Las actividades metablicas son constantes. Se da la condicin de crecimiento equilibrado, es decir, el incremento de la masa bacteriana est directamente relacionado (es proporcional) con el aumento de otros constituyentes celulares tales como el DNA, el RNA y la protena. Fase ESTACIONARIA Se acumulan productos txicos y se agotan los nutrientes. Las bacterias compiten por el acceso a los nutrientes. Algunas clulas mueren, otras crecen y se dividen. Fase MUERTE Mueren ms clulas que las que se producen. La tasa de muerte acelera. Dependiendo de la especie, todas las clulas mueren en cuestin de das o de horas. Agar No.11 Los nutrientes y factores de crecimiento son suministrados por los ingredientes como peptona, recopilacin de tejidos animales, casenas enzimticas hidrolizadas, extracto de levadura y extracto de carne vacuno. La dextrosa proporciona la fuente de carbono y energa. El agar proporciona la fuente de carbono y energa. El agar proporciona un excelente medio para la difusin de antibiticos y da zonas de inhibicin bien definidas. Su pH superior proporciona las

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condiciones ptimas para la actividad de antibiticos y tambin es compatible con el crecimiento de los organismos de prueba. Deben utilizarse placas recin preparadas para ensayos de antibiticos. Esterilizacin por calor hmedo El calor hmedo destruye los microrganismos por coagulacin de sus protenas celulares. El principal mtodo de esterilizacin que emplea el calor hmedo es la esterilizacin por vapor a presin. Existen otros mtodos de descontaminacin que emplean este tipo de calor los cuales, aunque no permiten la destruccin total de los microrganismos, disminuyen la carga microbiana que posee un material. Entre estos mtodos podemos citar a la Tindalizacin (esterilizacin fraccionada), agua hirviendo, pasteurizacin, olla de presin. Esterilizacin por vapor a presin La esterilizacin por vapor a presin se lleva a cabo en una autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presin de 15 libras lo que permite que la cmara alcance una temperatura de 121C. El tiempo de esterilizacin usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las caractersticas del material, es necesario variar el tiempo de esterilizacin. Esterilizacin por calor seco La esterilizacin por calor seco produce la destruccin de los microrganismos por oxidacin de sus componentes celulares. Este es un proceso menos eficiente que el calor hmedo porque los microrganismos, mueren con mayor rapidez cuando se encuentran en presencia de agua, ya que esta permite que se altere con mayor facilidad la configuracin de sus protenas y proporciona un medio para distribuir el calor uniformemente en toda la cmara interna del equipo de esterilizacin. Por esta razn, para lograr la esterilizacin del material empleando el calor seco, se deben aplicar temperaturas ms altas durante mayor tiempo. La esterilizacin por calor seco se puede realizar por varios mtodos: Aire caliente, llama directa, incineracin.

Objetivos
Objetivo general: Determinar la potencia de un antibitico (ampicilina) mediante el mtodo microbiolgico 2+2. Objetivo particular: Establecer la curva Dosis-Respuesta en un anlisis microbiolgico por el mtodo de difusin en placa.

Material
*4 cajas Petri con tapa de porcelana (estriles) *Matraz Erlenmeyer de 500ml *Matraz Erlenmeyer de 250ml *Pipetas graduadas de 1ml *Pipetas graduadas de 5ml *9 matraces volumtricos de 100ml *8 tubos de ensaye de 18x150 *Estufa *Incubadora *Perlas de ebullicin de vidrio

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*Pipetas graduadas de 10ml *16 penicilindros *Espectrofotmetro

*Pinza metlicas *Jeringas de 1ml

Metodologa
Mtodo 2+2 Preparacin de material. El material sometido a esterilizacin por calor hmedo fueron los matraces Erlenmeyer para preparacin de medio de cultivo, penicilindros, pipetas graduadas, pinzas y perlas de ebullicin se esterilizaron en autoclave a 121C a 15Lb de presin por 15 minutos. Las cajas Petri con tapa de porcelana se esterilizaron por calor seco a 180C por 2 horas. Preparacin de la muestra y el estndar Estndar Pentrexil ampicilina Diluciones: ( )( )( ( Muestra ampicilina solucin inyectable 1 g Diluciones: ( )( )( ( )( )( ) )( ) )( )( ) )( )

Preparacin de la solucin salina Se pesaron 0.9 g de NaCl y se aforaron en un matraz volumtrico de 100 ml, se esteriliz la solucin a 120 C y 15 libras de presin durante 15 minutos. Preparacin del Microrganismo. El microrganismo utilizado fue Micrococcus luteus, el cual estuvo bajo resiembra por dos semanas previas a su uso en Agar No.11. Para el ajuste de la suspensin del m.o se utiliz solucin salina al 0.9 % estril, se ley a 580 nm obtenindose una transmitancia de 24 %.

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Inoculacin de las placas

Agregar 21mL de Agar base No.11, reesterilizado a 4 cajas Petri con ayuda de una probeta de 25mL estril

Pipetear 4mL de ste Agar Semilla y agregar a las 4 cajas Petri con Agar Base y esparcir por toda la caja

Colocar 4 Penicilindros con ayuda de unas Pinzas estriles a distancias iguales (posicin 2+2)

Hacer una suspensin de Micrococcus luteus agregando 3mL de Solucin Salina estril y Perlas de Vidrio

Pipetear 0.5 mL de la suspensin siembra y agregar a un matraz Erlenmeyer con 100mL de Agar no.11, a temperatura de entre 32 y 37C

Llenar los Penicilindros de dilucin de antibitico con ayuda de Jeringas de Insulina hasta observar el menisco invertido; El orden se muestra a continuacin

Agregar la suspensin de M. luteus en un matraz Erlenmeyer de 125mL

Leer en Espectrofotmetro a 580nm hasta tener 25% de Transmitancia

A,B
STD 0.12

C,D
MTA 0.12

Incubar a 37C Y leer 2 das despus el tamao de los halos de inhibicin

MTA 0.06

MTA 0.06

STD 0.06

STD 0.06

STD 0.12

MTA 0.12

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Resultados
CONCENTRACIN 0.06g/mL 0.12g/mL
0 0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1 -1.2 -1.4 std mta 5 10 15 20

Estndar 13 16

Muestra 15 18

Anexos
Clculos. E=1/2((S2+T2)-(S1+T1)) E=1/2((16+18)-(13+15)) E=1/2((34)-(28)) E=1/2(6) E=3 F=1/2((T1+T2)-(S1+S2)) F=1/2((15+18)-(13+16)) F=1/2((33)-(29)) F=1/2(4) F=2 I= Log 2=0.3010 b=3/0.3010=9.9658 M= M= M=1.5874g/mg M= (1.5874)(950)= 1508.03g/mg

Potencia STD=950g/mg Potencia MTA=1508.03g/mg

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Anlisis de resultados
El mtodo 2+2 emplea 2 niveles de dosis tanto para la muestra como para el estndar del antibitico en estudio. La proporcin entre la dosis alta y la dosis baja es lo mismo para ambas preparaciones. Cada uno de los cuatro cilindros que contiene la caja incluye cada una de las cuatro dosis, este diseo se dice ser simtrico y balanceado. Mediante este mtodo se pueden comparar las dos lneas paralelas cada una correspondiente a la muestra o el estndar, su diferencia en potencia es revelada por la distancia vertical entre las dos lneas paralelas. Los resultados obtenidos por medio de los clculos y la grfica muestran que la potencia de la muestra genrica de ampicilina es ms potente que la estndar de patente. Cabe destacar que slo se obtuvieron cuatro halos de inhibicin, uno por cada concentracin de la muestra y el estndar, por lo que no fue posible calcular la media de las concentraciones altas y bajas; esto se puede deber a las condiciones de trabajo, preparacin de las diluciones, entre otros factores que afectan el experimento. La potencia microbiolgica de un antibitico puede disminuir por la fecha de caducidad del mismo, ya que el estndar de patente tena la fecha de caducidad ms prxima que la de la muestra genrica.

Conclusiones
Se obtuvo la potencia microbiolgica de una muestra de ampicilina con respecto a un estndar por medio del mtodo del 2+2.

Los halos de inhibicin son directamente proporcionales a la concentracin del antibitico.

Se evaluaron 2 muestras de ampicilina sdica obtenindose que la potencia microbiolgica de la muestra genrica fue mayor con respecto a la muestra estndar de patente.

Cuando por alguna razn la potencia de una sustancia no puede ser evaluada en trminos de sus propiedades qumicas o fisicoqumicas, como alternativa podemos considerar el ensayo microbiolgico.

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IX. BIBLIOGRAFIA SS. Farmacopea de los estados unidos mexicanos. 9ed. Mxico DF: Comisin Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 2008. P: 2428. Hewitt William, Microbiological Assay for Pharmaceutical Analysis, Interpharm CRC, Washington D.C., 2004, p.p. 9-21 Connors Kenneth A., Curso de anlisis farmacutico (ensayo del medicamento), edit. Reverte, S.A. New York USA, 1981, pag. 509-510.

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