CAPACITACIN Y REACCIN ACROSOMICA

La capacitacin y reaccin acrosomal del espermatozoide son eventos que se desarrollan en el aparato reproductor de la hembra y son indispensables para vertebrados de fecundacin interna. Estos eventos requieren inicialmente la eliminacin de los factores descapacitantes presentes en el semen, as como Una serie de cambios en el espermatozoide tanto lipdicos como proteicos de su membrana celular, la activacin de canales inicos, la sntesis de AMPc (adenosn monofosfato cclico), la fosforilaciondesfosforilacion proteica, la activacin de enzimas, la reaccin acrosomal con exocitosis y fusin de membranas, la vesiculacion y finalmente un aumento considerable de su movilidad. En este trabajo se hace una breve revisin de los mecanismos de transduccin de seales activadoras de estos eventos. La capacitacin es un proceso del espermatozoide que comprende una serie de cambios previos a la fecundacin, se desarrolla en el aparato reproductor femenino en vertebrados de fecundacin interna, y requiere de la comunicacin entre el espermatozoide y los ambientes que recorre en su trnsito hacia el sitio de fertilizacin. Cuando se une al ovocito, se induce otro proceso denominado reaccin acrosomal (exocitosis), as como la hpermovilidad, que es un movimiento especial del flagelo, el cual facilita su desplazamiento, la penetracin de las cubiertas del ovocito y finalmente la unin con este. Hay que aclarar que el proceso de capacitacin puede tambin ser inducido in vitro, para lo que una mejor comprensin de este fenmeno es mencionar que estructuralmente el espermatozoide se divide en: Cabeza. -Es el ncleo, con ADN super enrollado, gracias a las protenas denominadas protaminas Que sustituyen a las histonas en otros tipos celulares, con una envoltura nuclear (EN) de la cual se Han removido durante la espermiogenesis el complejo de poro nuclear (CPN), con excepcion de algunas especies que las presentan. El citoesqueleto participa en el soporte de la membrana plasmtica y de la membrana acrosomal y algunos de sus elementos son termosensibles. El principal elemento del citoesqueleto de la cabeza del espermatozoide es la teca peri nuclear (TP), que es una capsula rgida que cubre el ncleo del espermatozoide de mamferos y tiene como funcin la unin de las membranas espermticas y la preservacin de su integridad. La TP esta subdividida en dos regiones: las capas subacrosomal (sirve para anclarlo a las vesculas derivadas del aparato de Golgi) y postacrosomal. La capa postacrosomal se considera que participa en la activacin del ovocito durante la fertilizacin y es el sitio para la actina en los espermatozoides de algunos mamferos. En la regin apical de la capa subacrosomal del espermatozoide de toro, carnero y caballo, se ha detectado una subestructura llamada subestructura de la teca perinuclear (STP); el segmento ecuatorial, que es un complejo sper doblado de TP; la membrana acrosomal interna (MAI) y -membrana acrosomal externa (MAE) que transportan molculas receptoras involucradas en la unin esperma-ovocito; la vaina post acrosomal (VPA), la cual se cree que tiene un complejo de seales de protenas (CPS) o factores activadores del ovocito.

Flagelo.- Es la parte encargada del movimiento, se divide en cuatro regiones; la pieza de conexin, que une a la cabeza con el flagelo, la pieza media, que es tambin llamada cuello y donde se encuentran las mitocondrias en un arreglo helicoidal, la pieza principal que abarca la mayor parte del flagelo utilizado en la propulsin, y la vaina fibrosa o parte terminal de la cola (Fig. 1). Cada regin tiene funciones especficas en el movimiento, reconocimiento del ovocito y la fecundacin (Sutovski y Manandhar 2007).

Cambios durante la capacitacin

En el espermatozoide de cobayo, la F-actina est involucrada en la estabilizacin de la STP. La localizacin de la actina en la regin acrosomal de algunas especies de mamferos respalda su posible participacin en la capacitacin espermtica y en la reaccin acrosomal (RA); as, la polimerizacin y despolimerizacin de la actina pueden estar involucradas en la funcin espermtica. En el espermatozoide del cerdo, caballo, toro, ratn y carnero, la polimerizacin de la actina ocurre durante la capacitacin y el desdoblamiento de la F-actina debe ocurrir para que se lleve a cabo la RA. En el espermatozoide de verraco, la inhibicin de la polimerizacin de la actina bloquea su capacidad para fertilizar in vitro. A pesar de que al momento an falta mucho por conocer acerca de los mecanismos que inducen la capacitacin, se sabe que hay modificaciones lipoprotenas membrana les que: a) permiten la exteriorizacin de receptores

b) activan canales inicos que intervienen en la activacin de mecanismos de transduccin (flujo de calcio, sntesis de AMPc, fosforilacion-desfosforilacion de protenas, etc.) c) cambian el metabolismo energtico que conducen a la desestabilizacin de la membrana plasmtica a nivel de la regin acrosomica y la hper activacin del movimiento flagelar. Estos cambios permiten al espermatozoide responder a inductores especficos y experimentar la reaccin acrosomal al fin de la capacitacin

Prdida de los factores discapacitantes

Los factores discapacitantes son molculas que se originan en las secreciones testiculares, epididimarias y seminales y que funcionan protegiendo a los espermatozoides durante su periodo de almacenamiento en la regin caudal del epiddimo, estabilizando el acrosomal o inhibiendo la unin con la zona pelucida (ZP) del ovocito, por lo que es importante su remocin antes de la fecundacin, pues se ha sugerido que estos factores actan bloqueando a los receptores o grupos electrostticos localizados en la membrana. Cabe sealar que la cara externa de la membrana plasmtica es rica en carbohidratos cargados elctricamente (glicocaliz), en esta cara se encuentran los carbohidratos absorbidos o polisacridos unidos a la membrana por uniones superficiales no covalentes. As los factores discapacitantes, son susceptibles de enmascarar los sitios de la unin de receptores inicos o de activacin celular.

Cambios membranales
Bioqumicamente la membrana del espermatozoide est constituida por una bcapa lipdica y protenas unidas por interacciones no covalentes, los lpidos estn dispuestos en forma de una doble capa continua de 4 a 5 nm de grosor. Las protenas que estn incluidas en la bicapa lipdica realizan diversas funciones, como son: el transporte de las molculas especficas hacia el interior y exterior de la clula; mismas que actan como enzimas o catalizadores de las diversas reacciones y funcionan como receptores en la transduccin de seales. Adems de lpidos y protenas, la membrana tambin contiene carbohidratos, que en la mayora de los casos son cadenas de azucares simples o polisacridos. Los lpidos componen entre el 30 y el 50% de la membrana y de algn modo se encuentran anclados a su posicin. Aspecto que resulta importante para la fertilizacin pues la fusin de los gametos masculino y femenino, requiere la participacin particular de un microambiente de lpidos. Se ha determinado que en la superficie de la membrana del espermatozoide existe un alto nivel de fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, difofatidilglicerol, esterol y lpidos neutros, representando el 70-80%, as como un alto nivel de cidos grasos y algunos glucolpidos, que al parecer tienen una funcin importante, aunque no son tan abundantes como los fosfolpidos o esteroles, sumamente importantes para el espermatozoide, pues adems se ha observado que el cambio en la composicin de lpidos de la membrana plasmtica es una de las principales caractersticas de la maduracin espermtica, demostrndose, que el total de lpidos en esta clula disminuye con el paso a lo largo del conducto epididimario, considerando que la

fosfatidilcolina se encuentra estable en las tres principales regiones del epiddimo (cabeza, cuerpo y cola) y las cantidades de fosfatidiletalonamina, Fosfatidilserina y fosfatidilinositol declinan significativamente hasta llegar a la regin Caudal. Asimismo, la distribucin de las protenas en la membrana tambin cambia marcadamente entre la cola, pieza media y el acrosoma, y cuando se compara las protenas de la membrana espermtica con las de otros tipos celulares, los espermatozoides, probablemente exhiben el ms alto grado de polaridad, reportndose entre las protenas especficas de la membrana espermtica: _-1,4 galactosiltransferasa, fucosiltransferasa-d-manosidasa, sp56, p95, entre otras. De acuerdo al modelo de mosaico fluido, las protenas o glicoprotenas estn asociadas a la bicapalipdica mediante uniones no covalentes; otras que estn localizadas en la superficie de la membrana se asocian con interacciones electrostticas. Las membranas son un ensamble dinmico de protenas y lpidos capaces de responder a seales especficas que modifican las funciones celulares. Todas las membranas biolgicas poseen molculas superficiales que actan como receptores para diversos compuestos exgenos como enzimas, hormonas, protenas, etc. (Rosado, 1988). En el caso de los espermatozoides se han identificado receptores membranales a molculas como AMPc, esteroides, glucosaminoglicanos, cuya actividad se modifica durante la capacitacin (Gadella et. al, 2008). Los cambios en la topografa membranal dentro o fuera de las regiones especficas, pueden considerarse como adaptaciones fisiolgicas a las modificaciones ambientales (Flesch y Gadella, 2000). La redistribucin o los cambios estructurales en la topologa superficial de las molculas membranales ocurren, a travs de varios mecanismos: a) el enmascaramiento o desenmascaramiento de molculas superficiales, tanto por adsorcin de molculas y arreglo de protenas intrnsecas, b) la insercion local de las moleculas por adsorcin del medio y/o supresin de las mismas, c) la migracin de moleculas por la fijacin de ligandos (Gadella, 2008). Las protenas intrnsecas y no adsorbidas pueden ser modificadas por su extremo glicosilado, enmascarado o exteriorizndose, o desplazarse lateralmente como se ha observado con anticuerpos monoclonales o lectinas, las cuales denotan que la reactividad depende del grado de capacitacin. En el epiddimo, el espermatozoide presenta cambios en los dominios de los esteroles de membrana (complejos de esterol-caveolina), confirindoles una distribucin heterognea (Gadella, 2008). Estos dominios sirven como una barra transportadora para acoplar protenas que inducirn diferentes rutas de sealizacin). d) Como se haba mencionado la cabeza presenta dos subdominios: e) Acrosomal, presenta balsas lipdicas de composicin ordenada de colesterol y esfingolpidos, anclados a caveolinas, inmersas en una membrana de composicin desordenada, b) Subacrosomal, rica en fosfolpidos. Las balsas lipdicas son importantes en la compartamentalizacion hecha durante la espermatogenesis para la sealizacin en regiones especficas de la clula.

La capacitacin in vitro cambia el patrn de fijacin de estas molculas a partir de caveolinas, protenas especializadas en la regionalizacin de estas en sitios adecuados para un rearreglo de la capa superficial de las glicoprotenas, dejando libre la regin acrosomal; este reacomodo parece deberse al intercambio de glicoprotenas provenientes de las secreciones propias del aparato genital femenino y la membrana espermtica. Se ha demostrado que los cambios le generan la capacidad fertilizante a los espermatozoides, son iniciados por la fosforilacion dependiente de AMPc y simultneamente por los cambios de los lpidos membranales (Gadella, 2008). Un ejemplo claro de los cambios superficiales se ve con los grupos sulfhidrilo y amino. Si se bloquean estos sitios se interfiere con la reaccin acrosomal. La composicin de los fosfolpidos y su relacin molar con el colesterol que regulan la fluidez y la permeabilidad inica en las membranas cambia durante la capacitacin, este fenmeno est asociado a protenas captadoras de esteroles en el medio (Topfer-Petersen y col., 2008). Hiperactivacin son los cambios en la movilidad espermtica, caracterizado en: a) aumento en el movimiento y flexin del flagelo. b) gran amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza c) trayectoria curva y tortuosa. Genera la fuerza requerida para la penetracin de la capa de clulas de la granulosa y la insercion inicial del espermatozoide con el ovocito (Tulsiani, 2006). Para inducirla se requiere Ca++ extracelular, elevacin intracelular de AMPc y disminucin del pH intracelular. La hiperactivacion del flagelo se debe al Ca++ que se une a protenas fijadoras en el brazo externo de la dinena (en la parte interna del flagelo) induciendo el movimiento asimtrico (Inaba, 2003). Este Ca++ proviene de varias fuentes: a) Reservas intracelulares mediada por los receptores de inositol 1,4,5 trifosfato (IP3), b) Mitocondria c) ingresa por sistemas de transporte Na+/H+ y Na+/Ca++ (Gadella et. al, 2008).

Transporte de iones
Los espermatozoides mantienen gradientes inicos precisos a travs de su membrana plasmtica, mismos que son regulados por ATPasas dependientes de NA+/K+ y Ca++, as, la alteracin en la concentracin inica activa adenilato ciclasas, enzimas de origen acrosomal y enzimas relacionadas con los cambios en la movilidad (Gadella, 2008). Se ha reportado que una ATPasa dependiente de Ca++ en la membrana acrosomal externa, estimula la reaccin acrosomal, y cuando esta ultima es inducida, se genera la desaparicin del potencial de membrana. Se ha visto tambin que, la exocitosis es inhibida por una alta concentracin de Ca++ y un aumento en la captacin de Ca++ y Na+, as como la liberacin de H+/K+. En mamferos, se ha demostrado in vitro que un aumento en la relacin K+/Na+ en el medio, aumenta la tasa de fecundacin; aunque en otras especies el K+ extracelular inhibe la capacitacin, posiblemente porque la ATPasa funciona permitiendo el intercambio Na+/K+ y manteniendo una baja concentracin intracelular de Na+.

La zona pelucida (ZP) se une al menos con dos diferentes receptores en la membrana plasmtica del espermatozoide. Uno es el G1 o tirocin cinasa, que activa la fosfolipasa C_1; el otro es un receptor tirocin cinasa acoplado a fosfolipasa C. La unin con el receptor podr regular la adenilato ciclasa provocando el aumento del AMPc y la activacin de la proten cinasa, misma, que activa los canales de Ca++ dependientes de voltaje en la cara externa de la membrana acrosomal, la cual libera Ca++ desde el citosol del acrosoma. Este es el primer aumento de Ca++, el cual promueve la activacin de la fosfolipasa C. Los productos de la hidrolisis del fosfatidil inositol bifosfato por la fosfolipasa C, diacilglicerol e inositol-trifosfato, promueven la traslocacion de la proten cinasas y su activacin. La proten cinasa abre un canal de Ca++ dependiente de voltaje en la membrana plasmtica, provocando un segundo aumento de Ca++. El G1 puede tambin activar la fosfolipasa A2 para generar acido araquidonico a partir de fosfolpidos de membrana. El acido araquidonico sera convertido a prostaglandina y leucocitotrienos por las enzimas, ciclooxigenasas y lipooxigenasas, respectivamente. El aumento de Ca++ y el pH, sumado con lo anterior, provocan la fusin membranal y la exocitosis acrosomal.

Actividad enzimtica
El inicio y mantenimiento de la movilidad espermtica, estn asociados con la activacin de sistemas Enzimticos, hay evidencias de que la actividad de la adenilato ciclasa aumenta durante la capacitacin, la cual eleva la concentracin intracelular de AMPc. Estos cambios favorecen la movilidad vigorosa y estimulan la actividad de las cinasas dependientes de este nucletido. La fosforilacion de protenas es inducida por AMPc e induce cambios fisiolgicos de la membrana, a travs de modificar las estructuras de las protenas presentes en ella. La actividad de la fosfolipasa A esta asociada con los eventos de fusin caractersticos de la reaccin acrosomal. La accin de esta enzima sobre los fosfolpidos de la membrana provoca la acumulacin de lisofosfolpidos, que son compuestos capaces de producir fusin y lisis membranal (Flesch y Gadella, 2000). La reaccin acrosomal es especie especfica, e implica la existencia de moleculas para el reconocimiento entre los gametos masculino y femenino y generar la repuesta fisiolgica adecuada. Se sabe de la presencia en el fluido oviductal de factores para sealizacin extracelular y para el reconocimiento del ovocito. La reaccin acrosomal puede ocurrir espontneamente, y es posible inducirla in vitro. Es indispensable para la fecundacin y se genera como resultado de la accin de inductores adecuados (Rosado, 1988). Morfolgicamente, el acrosoma es parecido a un capuchn con una gran cantidad de enzimas hidrolitcas, se deriva del aparato de Golgi durante la espermiogenesis y por su origen, estructura y funcin celular, es comparable a un lisosoma (Gadella y col., 2008). Pero a diferencia de este, presenta exocitosis regulada por el metabolismo de fosfoinostidos, interaccin de nucletidos endgenos y exgenos, Ca++, calmodulina, microtubulos y microfilamentos. Hay fusin de membrana plasmtica y acrosomal externa en varios sitios, formando vesculas que se desprenden, quedando la membrana acrosomal interna ahora como nueva membrana de superficie. Las vesculas liberan su contenido a medida que el espermatozoide penetra a travs de la ZP. A partir del modelo de reaccin acrosomal han sido numerosos los grupos de investigacin que han trabajado en

este aspecto, sin embargo, no se conoce en la actualidad de manera precisa, la cascada de eventos que ocurren antes de la fusin de la membrana. Hay evidencias que sealan que la reaccin acrosomal in vivo comienza con la estimulacin de un agonista natural como es la progesterona o la ZP. Este estmulo provoca una entrada de Ca++ al espermatozoide. Por otro lado, se sabe que es posible inducir la reaccin acrosomal con el ionoforo A23187, el cual provoca la entrada de Ca++. Se ha propuesto un modelo en el que intervienen ATPasas de membranas cuya funcin es mantener bajos niveles de Na+ y Ca++ y altos niveles de K+. La entrada de Ca++ provoca la desactivacin de las ATPasas, adems de un aumento del Na+ intracelular con una salida de H+ y en consecuencia, un aumento del pH intraacrosomal, lo que induce la activacin de enzimas como la acrosina. Adems, se ha observado como el aumento de Ca++ intracelular, tambin conduce a una serie de modificaciones en los lpidos como la formacin de segundos mensajeros, que se incorporan a una cascada de acontecimientos que ocurre durante la reaccin acrosomica y la activacin de determinadas enzimas como una fosfolipasa A2, especifica de la fosfatidilcolina, que genera lisofosfatidilcolina y acido araquidonico, sustancias conocidas por sus propiedades de fusin necesarias en la reaccin acrosomal. La induccin de la reaccin acrosomal se ha caracterizado al microscopio electrnico en 5 etapas, (Gadella et. al, 2008): 1) Acrosoma, membrana acrosomal y plasmtica intactas, matriz acrosomal homognea y compacta. 2) Hinchamiento de la matriz acrosomal, membranas intactas. 3) Invaginacin de la membrana acrosomal externa, con la presencia de muchas vesculas dentro del capuchn acrosomal por la fusin de membranas. 4) Fusin de membrana plasmtica y acrosomal; prdida de casi toda la matriz acrosomal. 5) Perdida de las membranas plasmtica, acrosomal, y de toda matriz acrosomal. Bioqumicamente la reaccin acrosomal se caracteriza por la activacin de las enzimas acrosomales y la secrecin de algunas de ellas, antes de la formacin de vesculas. El calcio desempea un papel fundamental en todos los mecanismos de exocitosis, principalmente el Ca++ extracelular. In vitro, en medios libres de Ca++ no hay reaccin acrosomal, aun adicionando al medio agentes inductores (Gadella y Harrison, 2000). Otra caracterstica es la necesidad de glucosa en el medio de incubacin para que el proceso se lleve a cabo normalmente, aunque esta propiedad parece ser dependiente de la especie, puesto que en algunas es posible inducirla sin su presencia (Topfer-Petersen y col., 2008). La mayora de los estudios realizados al respecto han sido in vitro y es difcil extrapolar estos resultados a las condiciones fisiolgicas in vivo. Hay consenso de que la ZP es inductora y que los ionoforos de Ca++ imitan su efecto (Gadella y Harrison, 2000). El reconocimiento especfico de los gametos, la fijacin del espermatozoide con su acrosoma intacto, la induccin de la reaccin acrosomal y del bloqueo para la polis permia estn relacionados con la ZP, as que su estructura glucoproteica, hace que el mecanismo de interaccin sea por un sistema de reconocimiento antgenoanticuerpo (Gadella y col., 2008). La fraccin conocida como ZP3, es la protena involucrada en la fijacin y reaccin acrosomal, ocurrida esta, el espermatozoide puede entonces penetrar (Gadella y Harrison 2000) e interaccionar con la ZP2,

la cual mantiene firme esta interaccin. Bajo condiciones in vitro varias hormonas, neurotransmisores e intermediarios del metabolismo de lpidos funcionan como inductores, la mayora de ellos estn presentes en el lquido folicular y son las catecolaminas, prostaglandinas, esteroides, serotonina y cidos grasos (Flesch y Gadella 2000). La progesterona es inductora a travs de un mecanismo de receptores especficos presentes en la membrana plasmtica de la regin acrosomal, causando un transporte de Ca++ hacia el interior y en consecuencia elevando considerablemente su concentracin. Transduccin de seales en capacitacin y reaccin acrosomal. En este proceso interviene la protena G (PG, es una familia de protenas, caracterizada por ser un complejo de protena-GDP (Guanosn difosfato) con actividad de GTPasa), GDP, GTP y AMPc. Los sistemas transductores de seales estn diseados para responder a cambios en el estado de equilibrio de la protena G, GDP, GTP. En condiciones basales la actividad de GTPasa supera la velocidad de intercambio GDP/GTP inactivando a la protena G (PG). La estimulacin depende del intercambio de GDP por GTP en la PG activada y de la velocidad de hidrolisis de la GTP. La constante intrnseca de hidrolisis es de 0.5 a 5 min y los efectores la aceleran de 10 a 50 veces. La protena G se formada por las subunidades alfa, beta y gama, durante el cicloade GTPasa. La subunidad alfa pasa por tres conformaciones: Complejo heterometrico inactivo, alfa-GDP-betagama, hay gran afinidad por beta y gama. Transicin alfa-V, la estimulacin por unin al ligando disminuye la afinidad al complejo heteromerico, formandose otro estabilizador de la unin y Activa, se forma el complejo alfa-GTP, separacin del receptor activado, beta y gama, la hidrolisis del GTP cierra el ciclo, inactivndose alfa. Se ha estudiado el papel de las protenas G en ratn, toro y humano, su inactivacin no interfiere con la fijaciaon del espermatozoide a la ZP, pero inhibe casi por completo la reaccin acrosomal (Almog y Noar 2008, Rosado 1988). Algunas de sus funciones son: Activacin o inhibicin de la adenilato ciclasa, estimulacin de la fosfodiesterasa retiniana y de la hidrolisis de fosfoinostidos y finalmente la regulacin de canales inicos. En resumen, la secuencia de activacin para la capacitacin y reaccin acrosomal es como se describe a continuacin: el complejo heterometrico es incapaz de activar la adenilato ciclasa, al unirse el ligando hormona-receptor libera el GDP, sustituido por GTP formndose el intermediario activo. La subunidad alfa fija el GTP, separndose de beta y gama, activando la adenilato ciclasa, la cual genera AMPc, este a su vez, activa las protein cinasas. La PG es GTPasa de accin lenta, el GTP pegado a alfa provoca la extincin progresiva de la seal transmitida por el ligando. La estimulacin depende del intercambio de GDP por GTP en la protena G activada y de la velocidad de hidrolisis del GTP. La transduccin funciona como un circuito de amplificacin de la seal desde que el ligando se une al receptor. La seal se ampla conforme se activan ms protenas G, generando a su vez ms AMPc. Finalmente cada proten cinasa activada, fosforila ms protenas, lo cual es el paso final del mecanismo de activacin. Muchos de los efectos del AMPc en clulas eucariontes son a travs de la activacin de protein cinasas de dos subunidades, una reguladora unida al AMPc y otra cataltica. En ausencia de AMPc el complejo es inactivo, al unirse este se separa el complejo y se activa la actividad enzimtica (Almog y Naor, 2008).

Bibligrafia
http://www.izt.uam.mx/contactos/n78ne/fisiologica.pdf Almog T, Naor Z. Mitogen actived protein kinases (MAPKs) as regulators of spermatogenesis and spermatozoa fuctions. Mol & Cell Endo 282: 39. 2008.