CBTis

PRUEBAS TRANSFUSIONALES
CUADERNILLO DE PRACTICAS DE LABORATORIO

ESPECIALIDAD LABORATORISTA CLINICO V SEMESTRE ALUMNO:____________________________________________

CONTENIDO Objetivo Fundamentacin Practica 1 Prctica 2 Prctica 3 ASEPSIA Y VENOPUNCIN A DONADORES DETERMINACION DE LA FORMULA ROJA DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS SISTEMAS ABO Y RH (MTODO DIRECTO EN TUBO) Prctica 4 Prctica 5 DETERMINACION DE SUBGRUPOS A1 Y A2 DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO

SISTEMA ABO (MTODO: INVERSO) Prctica 6 Prctica 7 Prctica 8 Prctica 9 Prctica 10 Prctica 11 Prctica 12 DETERMINACION DE LA VARIEAD DU REACCIONES FEBRILES DETERMINACIN DE V.D.R.L. Y R.P.R. DETERMINACION DE VIH Y HEPATITIS C PRUEBA DE COOMBS DIRECTA PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD (PRUEBAS CRUZADAS) Bibliografa

OBJETIVO

El alumno conoce y aplica las tcnicas adecuadas para: la seleccin de donadores de sangre segura y las tcnicas de recoleccin de sangre, adems realiza las diferentes pruebas pretransfunsionales para una compatibilidad sin riesgo; de igual forma se busca que el alumno tenga los conocimientos, habilidades y destrezas necesarios para que pueda obtener y clasificar los diferentes hemoderivados de la sangre para su conservacin, transporte y utilizacin.

FUNDAMENTACION

La sangre hasta hoy es irreemplazable, no existe en forma artificial. Varios componentes sanguneos, en particular los celulares, as como sus funciones, son demasiado complejos para ser "fabricados". Por lo tanto, la transfusin sangunea es la nica alternativa para ciertos pacientes. Con este submdulo el estudiante conoce y aplica los procedimientos y tcnicas para seleccionar a los voluntarios sanos para donar, recolectar la sangre, estudiarla, separarla en sus componentes, conservarlos adecuadamente para tenerlos disponibles para los pacientes que tienen deficiencia de alguno de ellos o perdidas por accidentes, cirugas o por enfermedades sistmicas.

PRACTICA: 1

ASEPSIA Y VENOPUNCIN A DONADORES

OBJETIVO: Que el alumno conozca el procedimiento, materiales y cuidados que se deben tener durante una flebotoma a donadores a fin de robustecer su desempeo en el banco de sangre. FUNDAMENTO: La contaminacin bacteriana de la sangre y sus componentes es un problema significativo en la prctica transfusional. La sangre y sus componentes pueden contaminarse de manera exgena y endgena. La desinfeccin inadecuada del sitio de venopuncin puede aumentar la probabilidad de contaminacin. Se debe tomar como rutina una tcnica en especial para la desinfeccin del brazo de los donadores para que de esta manera se reduzca la posibilidad de contaminacin bacteriana, de la sangre y sus componentes, que puede ocasionar infeccin y en casos graves la muerte del paciente a transfundir. MATERIAL Y EQUIPO: - Dos pinzas de Nelly - Bolsa recolectora de sangre (sencilla, doble o triple) - Tijeras - Tubos de ensaye con y sin anticoagulante (EDTA) - Gasas estriles y cinta adhesiva - Torundas con alcohol - Jabn lquido e isodine espumoso (cutneo) - Fumarato Ferroso CARACTERISITICAS DE LOS MARBETES (ETIQUETAS) EN LAS BOLSAS RECOLECTORAS DE SANGRE Y SUS FRACCIONES Nombre, domicilio y telfono del establecimiento - Nombre del donador y anotar el tipo de donacin: familiar o altruista - Identificacin del grupo sanguneo ABO con letras de 3X3 cm siguiendo las indicaciones del CODIGO INTERNACIONAL DE COLORES
-

 Amarillo para el gurpo A Azul para el gurpo B Rojo para el grupo AB Negro para el grupo O - Indicacin del factor Rh (con palabras POSITIVO O NEGATIVO) - Fecha de extraccin y caducidad de acuerdo al anticoagulante Empleado. - Sealar el volumen y producto conservado - Se inscribir el resultado de las pruebas de laboratorio efectuadas - Llevar la leyenda consrvese entre 4 6 C - En caso de que el producto se encuentre preparado para un receptor determinado, anotar el nombre completo del paciente, nmero de cama, servicio y resultado de las pruebas de compatibilidad pretransfusionales. - Si el producto est pendiente de ser dado de baja, sealarlo claramente en la etiqueta con la leyenda BAJA, NO USAR.

ACTIVIDAD: 1.- Consultar porqu son los citratos los anticoagulantes utilizados para almacenamiento de las unidades de donacin. 2.- Dibujar una bolsa de donacin y especificar sus componentes. 3.- Investigar la utilidad de las bolsas satlites de las unidades de donacin.

POSICION DEL DONADOR Y FLEBOTOMIA - El donador debe de estar recostado en una posicin elevada para que el tcnico que realice la venopuncin, no se incline. - Es importante que el donador se encuentre en ayuno, y en casos urgentes con mnimo de cuatro horas. - Para realizar la flebotoma (tcnica de venopuncin), se escoge una vena grande de la regin antecubital generalmente la vena media. Una vez seleccionada se procede a realizar la asepsia. - Asepsia: Limpiar una zona en circulo de aproximadamente 8 a 10 cm de dimetro con jabn lquido (vigorosamente), eliminar el jabn con una torunda con alcohol y posteriormente aplicar una solucin desinfectante por dos minutos, se utiliza el isodine espumoso (solucin yodada), quitar el isodine con una torunda con alcohol. Una vez realizada la asepsia , ESTA REGION NO SE DEBE TOCAR. - Colocar el torniquete en el brazo indicando al paciente que cierre el puo. - Se efecta un nudo flojo en el tubo de hule de la bolsa, se pinza y se retira el protector de la aguja. Posteriormente se punciona con el bisel hacia arriba y siguiendo el curso de la vena. - Retirar las pinzas y al aparecer el flujo de sangre con velocidad constante, fijar la aguja con cinta adhesiva. - Colocar la bolsa recolectora a un nivel inferior al brazo del donador, aflojar el torniquete ( no lo quite ) para que la sangre fluya por gravedad. - Mezclar la bolsa con movimientos continuos de arriba hacia abajo hasta terminar el sangrado, para asegurar la mezcla con el anticoagulante. - Inspeccionar continuamente la posicin de la aguja y observar que no se presenten cogulos, la sangre debe fluir libremente. - Una vez terminada la recoleccin, colocar dos pinzas Nelly en el tubo de Hule inmediatamente despus de la regin de puncin y cortar con unas tijeras en medio de ellas. - Llenar dos tubos, uno con anticoagulante y otro sin el, como tubos pilotos, esto se realiza despinzando el trozo de tubo de hule que aun permanece insertado en el brazo.

- Volver a pinzar y retirar el torniquete y las cintas adhesivas. Extraer la aguja lentamente y colocar una torunda con alcohol, doblar el brazo indicando al donador que permanezca en reposo durante 10 min. - A la unidad de sangre recolectada, extraer las burbujas de aire y cerrar el tubo de hule con nudos o utilizando un sellador elctrico, almacenarla en el refrigerador de 4 6 C. - Despus de permanecer 10 minutos en reposo, el donador, se le proporciona una dieta principalmente rica en lquidos y se le administran pastillas de Fumarato ferroso (se le indican 20 comprimidos para que tome una pastilla despus de cada alimento). - En caso de desmayo, coloque los pies del donador a un nivel superior y que aspire una torunda con alcohol.

ACTIVIDAD: 1.- Cuanto es el tiempo estimado para la sangra de un donador? 2.- Que complicaciones se pueden presentar cuando se rebasa el tiempo de sangra del dondaor?. 3.- Cuales son las concentraciones indicadas para los antispticos utilizados en la flebotoma a donadores? 4.- Cual es la finalidad de seccionar la manguera de la unidad de sangre con nudos o con sellos durante su almacenamiento?

PRACTICA: 2

DETERMINACION DE LA FORMULA ROJA

MTODOS

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA POR CIANOMETAHEMOGLOBINA Y DETERMINACION DEL MICROHEMATOCRITO

OBJETIVO: El alumno realiza la determinacin de Hemoglobina y hematocrito para valorar en un primer plano el estado de la sangre de un posible donador dentro del banco de sangre. FUNDAMENTO: La frmula roja consiste generalmente en la determinacin de la concentracin de hemoglobina, el hematocrito y los ndices hemticos (o eritrocitarios). Con el surgimiento de los contadores electrnicos de clulas se ha incluido el recuento total de eritrocitos MATERIAL Y EQUIPO: - Tubos de ensayo - Pipetas serolgicas de 10 ml - Pipeta de Sal - Boquilla - Capilares - Mechero Bunsen - Gradilla para tubos - Centrfuga - Solucin de Drabkin - Tubos con anticoagulante EDTA - Tabla de lectura para hematocrito - Espectrofotmetro PROCEDIMIENTO: MICROHEMATOCRITO 1.- Homogeneizar la muestra y llenar un tubo capilar a 2/3 partes de su capacidad. 2.- Sellar con plastilina o al calor uno de los extremos del capilar 3.- Centrifugar durante 5 minutos a 11,000 r.p.m. 4.- Obtener el % de Hematocrito con una tabla o por clculo. 5.- Registrar el resultado. HEMOGLOBINA (CIANOMETAHb)

1.- Homogeneizar la muestra y con pipeta de Salhi recoger 20l () de sangre. 2.- Colocar la muestra en un tubo de ensaye preparado con 5 ml de Rvo. de Drabkin 3.- Mezclar y dejar reposar durante 10 minutos 4.- Leer Absorbancia en espectrofotmetro a 540 nm 5.- Interpretar con la curva correspondiente o un factor. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS: Dependiendo de los valores obtenidos para Hb, Hto e IE, se valorar al donante para su aceptacin o rechazo de acuerdo a los requisitos de donacin establecidos por el Sector Salud. VALORES DE REFERENCIA HEMATOCRITO: HEMOGLOBINA: Hombres Mujeres 40 54 % 37 47 %

Hombres: 13.5 17.5 gr/dl Mujeres: 12.0 15.5 gr/dl

ACTIVIDAD: 1.- En la actualidad que procedimientos realizan los bancos de sangre para determinar la formula roja de los donadores? 2.- Que ventajas ofrecen stos procedimientos?

PRACTICA: 3

DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS SISTEMAS ABO Y RH

MTODO DIRECTO EN TUBO OBJETIVO: Que el alumno aprenda y aplique el mtodo para la identificacin de antgenos eritrocitarios como prembulo a la compatibilidad de una unidad de sangre, utilizando antisueros comerciales. FUNDAMENTO: El sistema ABO es el nico sistema sanguneo en que el plasma y el suero contienen aglutininas que reaccionan con los antgenos presentes en los hemates de otras personas. Por estas reacciones de antgeno anticuerpo (Ag-Ac) Landersteiner demostr la presencia de grupos sanguneos ABO. La isoaglutinacin se lleva a cabo a temperatura ambiente (20 25 C), y las isoaglutininas (Ac responsables de la aglutinacin) son del llamado tipo Completo ( Inmunoglobulinas M, IgM). El factor Rh se descubri en 1940 por Landsteiner y Wiener realizando estudios en monos Rhesus. En conclusin se investig que en la membrana de los eritrocitos se puede encontrar en la mayora de las personas un Ag el D que es el que designa el Rh. MATERIAL Y EQUIPO: Tubos de ensayo Pipetas Pasteur Gradilla para tubos Centrfuga Solucin salina fisiolgica (0.85%) Anticoagulante EDTA Antisueros A, B, AB y D

PROCEDIMIENTO: 1.- Rotular cuatro tubos como A, B, AB y D. 2.- Colocar una gota del antisuero, a cada tubo respectivamente. 3.- Colocar a cada uno de los cuatro tubos una gota de eritrocitos, previamente lavados y diluidos al 2 -5% en SSF. 4.- Mezclar y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 15 a 30 segundos. 5.- Resuspender las clulas (el botn) cuidadosamente y observar la presencia de aglutinacin macroscpica. Registrar los resultados. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS: SISTEMA ABO.AGLUTINACION EN: Tubo A y tubo AB Tubo B y tubo AB Tubo AB
No hay aglutinacin en tubos A, B y AB.

GRUPO SANGUNEO: A B AB O

SISTEMA Rh.Si aglutina en tubo D Si no aglutina en tubo D Rh Positivo Rh Negativo

OBSERVACIONES: La presencia de Ag y Ac en el sistema sanguneo ABO se confirman en la prctica de GRUPO INVERSO. A todos los Rh negativos se les practicar la variedad dbil del Ag D (Du).

PRACTICA 5

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO

MTODO: INVERSO OBJETIVO: Que el alumno conozca y aplique el procedimiento para determinar los anticuerpos del sistema ABO presentes en una muestra de suero o plasma utilizando eritrocitos de grupo sanguneo conocido. FUNDAMENTO: El grupo inverso tambin llamado srico o de confirmacin (afirmagn) se determina probando el suero o plasma de una muestra de sangre con eritrocitos conocidos de grupo A y B (al 25% en solucin salina). El grupo inverso se determina con los Ac del suero tanto del donador como del receptor; los Ac investigados son: anti-A, anti-B, anti-AB o ninguno. MATERIAL: - Pipetas Pasteur - Tubos de ensaye - Centrfuga - Gradilla PROCEDIMIENTO: 1.- Rotular dos tubos de ensayo como A y B respectivamente. 2.- Al tubo A, agregar dos gotas de suero o plasma del paciente y una gota de glbulos rojos conocidos A. 3.- Al tubo B, agregar dos gotas de suero o plasma del paciente y una gota de glbulos rojos conocidos B. 4.- Mezclar, centrifugar a 3,000 r.p.m. por 15 segundos y observar la aglutinacin. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS: AGLUTINACION Eritrocitos A B AB GRUPO SANGUINEO B A O REACTIVOS: - Clulas conocidas A - Clulas conocidas B - Solucin salina

CONTROL DE CALIDAD: Es importante comprobar la eficacia de los reactivos principalmente que tanto las clulas conocidas como el suero o plasma no se encuentren hemolizados ni contaminados. ANTIGENOS A B AB
AUSENTE A,B

D AUSENTE D

ANTICUERPOS anti-B anti-A NINGUNO anti-A y anti-B NINGUNO NINGUNO

GRUPO A B AB O Rh POSITIVO Rh NEGATIVO

ACTIVIDAD: 1.- Esquematiza los sistemas antignicos ABO y Rh, as como las inmunoglobulinas correspondientes a stos sistemas. 2.- Cual es el origen de las inmunoglobulinas de grupo sanguneo del sistema ABO en los seres humanos?

PRACTICA 4

DETERMINACION DE SUBGRUPOS A1 Y A2

OBJETIVO: Que el alumno conozca el procedimiento para identificar los subgrupos de A, aplicando el mtodo de aglutinacin directa utilizando un antisuero comercial. FUNDAMENTO: G.W. Bird en 1952 descubri un estrato preparado a partir de semillas de Dolichus biflorus que aglutinaba solamente con los hemates humanos del grupo A1. El anti-A1 lectina usado con tcnicas serolgicas apropiadas puede ayudar a distinguir entre los subgrupos anguneos A1, A1B, A2, A2B y otros subgrupos dbiles de A. La lectina anti-A1 contiene una fitoaglutinina que aglutina con los hemates humanos del subgrupo A1, pero no aglutina con los subgrupos dbiles de A. MATERIAL: - Solucin salina fisiolgica - Tubos de ensaye - Gradilla - Pipetas Pasteur - Centrfuga REACTIVOS: - Lectina anti-A1

PROCEDIMIENTO: 1.- Preparar una suspensin de clulas lavadas al 2 5% en solucin salina. 2.- Etiquetar un tubo de ensaye para la identificacin apropiada. 3.- Dispensar dos gotas de Lectin-A1, en el tubo etiquetado. 4.- Aadir una gota de la suspensin de las clulas al 2 - 5%. Mezclar. 5.- Centrifugar 1000 r.p.m. durante 30 segundos. 6.- Resuspender las clulas (el botn) cuidadosamente deslizando la muestra de forma horizontal- y observar la presencia de aglutinacin macroscpica. Registrar los resultados. CONTROLES: La reactividad del producto debe confirmarse cada da antes de usarse mediante el empleo de clulas conocidas del grupo A1 (control positivo) y clulas conocidas del grupo A2, B y O (control negativo).

ITERPRETACION DE RESULTADOS: 1.- Subgrupos A1 y A1B aglutinan 2.- Subgrupos A2, A2B, y otros subgrupos dbiles de A no aglutinan. LIMITACIONES DE LA TCNICA: No incluir tubos de ensaye a 37 C. El test en portaobjetos debe ser ledo en un tiempo no superior a un minuto.

ACTIVIDAD: 1.- Qu es el Dolichus biflorus? 2.- Consultar que es una fitoaglutinina 3.- Esquematiza la reaccin Ag-Ac entre la fitoaglutinina y el Ag eritrocitario

PRACTICA 6

DETERMINACION DE LA VARIEAD DU

OBJETIVO: Que el alumno conozca y aprenda el procedimiento para detectar alguna irregularidad o ausencia del Ag D, expresin que se encuentra regulada genotpicamente y cuyo fenotipo implica una gran importancia en la prevencin de reacciones hemolticas de Recin Nacidos o postrasnfusionales. FUNDAMENTO: Se basa en la reaccin del Ag Du con el Ac incompleto gamma globulina, que posteriormente reacciona con el Ac intermedio antigamma globulina (suero de Coombs) para formar un puente entre la gamma globulina facilitando el acercamiento de los eritrocitos y as provocar la aglutinacin en caso de que los eritrocitos contengan el Du. MATERIAL: - Tubos de ensaye - Tubo con anticoagulante (EDTA) - Pipeta Pasteur - Suero anti - D - Suero de Coombs (anti gamma globulina o anti globulina humana) - Centrfuga PROCEDIMIENTO: 1.- Preparar una suspensin de eritrocitos problema lavados al 5 %. 2.- Tomar una gota de la suspensin al 5% y colocarla en un tubo de ensaye, agregar una gota del suero anti D e incubar durante 15 minutos a 37 C. 3.- Observar la presencia o ausencia de aglutinacin: En caso negativo continuar con tres lavados de la muestra con solucin salina. En caso positivo se termina el procedimiento y se reporta Rh POSITIVO. 4.- Al residuo ya lavado se le agrega una gota del suero de Coombs, mezclar e incubar durante 30 min. A 37 C. 5.- Observar la presencia de aglutinacin.

INTERPRETACION: Presencia de aglutinacin Sin aglutinacin Reportar variedad Du Positiva Reportar Variedad Du Negativa

ACTIVIDAD: 1.- Explica la relevancia clnica de sta prueba

2.- Esquematiza la estructura bioqumica del Ag D

3.- Qu es el suero de Coombs y que papel juega en sta determinacin?

PRACTICA 7

DETERMINACION DE ANTIGENOS FEBRILES

FUNDAMENTO: La prueba se basa en una reaccin inmunolgica entre los anticuerpos sricos y el antgeno correspondiente produciendo una reaccin de aglutinacin macroscpica. OBJETIVO: El Alumno recuerda y aplica la identificacin de antgenos bacterianos mediante una reaccin de aglutinacin como criterio para aceptar o descartar a un donador al comprobar la ausencia o presencia de stos respectivamente en una muestra de suero. MATERIAL: Tubos de ensaye 13X100 Placa de vidrio Aplicadores Gradilla Pipeta serolgica de 1 ml Pipeta Pasteur Tubo al vaco sin anticoagulante Lmpara REACTIVOS: Muestra de suero Tifico O y H Paratifico A y B Proteus OX-19 Brucella abortus

PROCEDIMIENTO: 1.- Llevar los reactivos a temperatura ambiente antes de realizar la prueba. 2.- Rotular la placa segn el Ag a investigar 3.- Depositar en la placa de vidrio 0.04 ml del suero problema (el cual debe ser totalmente claro para la prueba), 0.02, 0.01 y 0.005 de forma secuenciada en cada uno de los sitios marcados para cada Ag. 4.- Mezclar el frasco del Ag con movimientos circulares sobre la mesa para homogeneizar la suspensin y agregar una gota (30 l) de cada Ag en uno de los sueros previamente depositados. 5.- Mezclar el Ag y el suero utilizando un aplicador diferente para cada una de las cantidades de suero. 6.- Girar la placa manualmente o utilizando un agitador mecnico (120 rpm) durante 2 minutos. 7.- Realizar la lectura utilizando una fuente de luz directa y observar la aglutinacin macroscpica de acuerdo a la siguiente tabla de algutinacin:

4+ 3+ 2+ 1+ Neg.

Aglutinacin del 100% de los organismos Aglutinacin del 75 % de los organismos Aglutinacin del 50 % de los organismos Aglutinacin del 25 % de los organismos Aglutinacin del 0 % de los organismos

INTERPRETACIN: El ttulo del suero ser la inversa de la dilucin ms alta en donde se observa una aglutinacin del 50 % de organismos (2+). VO LUMEN DEL SUERO 0.0l4 ml 0.02 m 0.01 ml 0.005ml TITULO 1:40 1:80 1:160 1:320

ACTIVIDAD: 1.- Qu tipo de respuesta inmunolgica induce la infeccin por stos microorganismos? 2.- Por que se utiliza el Ag OX-19 de Proteus y que bacteria nos permite identificar en sta prueba? 3.- Qu es la reaccin de Huddleson y que permite detectar? 4.- Qu es un ttulo de anticuerpos? 5.- Que limitaciones presenta el procedimiento? 6.- Por qu a la Brucelosis o fiebre de malta tambin se le denomina Fiebre ondulante?

PRACTICA 8

PRUEBA DE V.D.R.L. PARA IDENTIFICACION DE SIFILIS METODO CUALITATIVO FUNDAMENTO: La prueba de V.D.R.L. es una prueba de floculacin no treponmica microscpica que es utilizada para detectar y cuantificar reaginas, un Ac anti-lipdico (cardiolipina y lectina) encontrado en el suero o plasma de personas con sfilis y ocasionalmente en personas con infecciones agudas o crnicas en otras condiciones aparte de la sfilis. OBJETIVO: El alumno recuerda y aplica el procedimiento de la prueba de V.D.R.L. como criterio para aceptar o descartar a un donador en funcin del resultado obtenido al analizar una muestra de suero. MATERIAL: Tubo al vaco sin anticoagulante Placa horadada para V.D.R.L. Microscopio Pipeta serolgica desechable Pipeta Pasteur REACTIVOS: Suero problema Reactivo para V.D.R.L.

PROCEDIMIENTO: 1.- Rotular los pocillos de la placa como Muestra, Control Positivo y Control negativo. 2.-En uno de los pocillos de la placa de vidrio, dispensar 0.05 ml del suero con pipeta desechable 3.- En pocillos diferentes y previamente marcados colocar una gota de suero control positivo y negativo, extender sobre la superficie del anillo. 4.- Aadir una gota del Ag en suspensin estabilizado previamente y resuspendido, en cada una de las muestras utilizando la aguja No. 21 sin bisel. 5.- Agitar la muestra durante 4 minutos con movimientos ondulatorios. 6.- Pasados los 4 minutos leer inmediatamente al microscopio con objetivo de 10X. INTERPRETACIN: POSITIVO: Presencia de floculacin mediana o grande, comparable con el control Positivo. NEGATIVO: Ausencia de floculacin.

ACTIVIDAD: 1.- Que es la cardiolipina y por que se utiliza para el diagnstico de sfilis? 2.- Qu mtodos son en la actualidad utilizados para el diagnstico de sfilis, enlista en orden decreciente de importancia clnica? 3.- Qu es la floculacin? 4.- Qu otro mtodo nos permite identificar de forma eficaz y rpida sta enfermedad?

PRACTICA 9

IDENTIFICACIN DE VIH Y HCV

METODO: INMUNOCROMATOGRAFICO CUALITATIVO FUNDAMENTO: La prueba se basa en poner en contacto una muestra de suero con un conjugado de Ag viral-oro coloidal (VIH o HCV) embebido en el pocillo de muestra el cual reacciona con los Ac presentes en la muestra formando un complejo Ac-Ag-conjugado, la mezcla emigra a lo largo de la tira de prueba el cual es captado por un Ag de VIH recombinante inmovilizado en una membrana y formando una banda colorida en la regin de prueba. Una muestra negativa no produce una banda colorida debido a la ausencia del complejo conjugado de oro coloidal/anticuerpos (anti-VIH o anti-HCV). Los Ag utilizados en la prueba de conjugado son protenas recombinantes altamente inmunoreactivas de VIH-1 y VIH-2. Una banda coloreada en la regin control aparece al final de la prueba sin considerar el resultado de la prueba. Esta banda control es el resultado de la unin del conjugado de oro coloidal al anticuerpo viral (VIH o VIH) inmovilizado en la membrana. La banda control indica que el conjugado de oro coloidal es funcional. OBJETIVO: El alumno recuerda y aplica el procedimiento inmunocromatogrfico para identificacin de virus (VIH y HCV) dentro del proceso de seleccin del donador, a fin de dar seguridad a la sangre para donacin. MATERIAL: Tubo al vaco sin anticoagulante Vial de reaccin para VIH y HCV Pipeta Pasteur Tubo de ensaye 13X100 Gradilla REACTIVOS: Suero Problema
Solucin de lavado para VIH y HCV

PROCEDIMIENTO: 1.- No abrir los sobres sellados hasta que se est listo para la prueba. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente. 2.- Sacar el cartucho de su sobre y colocarlo en una superficie seca. 3.- Identificar los cartuchos para cada muestra o control.

4.- Colocar una gota de muestra o control (con el gotero proporcionado) en el pocillo S. 5.- Posteriormente agregar 1 gota del diluyente en el pocillo S (para prueba de VIH) y en el pocillo D (para prueba de HCV). INTERPRETACION: POSITIVO: Tanto la banda de prueba como la banda control se colorea de rojo prpura. NEGATIVO: Solo la banda control aparece de color rojo prpura en la membrana. INVALIDO: siempre tendr que haber una banda color rojo prpura en la regin de control independientemente del resultado de la prueba. Si la banda control no se observa la prueba se considera invlida. Repetir la prueba empleando un nuevo cartucho. C T Positivo C T C T Negativo C T Invlido C T

ACTIVIDAD: 1.- Que es un mtodo inmunocromatogrfico? 2.- Qu muestras pueden ser utilizadas para ste mtodo? 3.- Cul es la importancia clnica de realizar stas determinaciones en una unidad de donacin?

PRACTICA 10

IDENTIFICACIN DE HBsAg

FUNDAMENTO: Inmunoensayo de oro coloidal cuya reaccin es tipo sandwish, que detecta el Ag de superficie de la Hepatitis B en muestras de sangre total, suero o plasma. El anti-HBsAg es inmovilizado en la regin de prueba de la membrana de nitrocelulosa. Durante el ensayo la muestra inicial reacciona con el complejo del Ac monoclonal-conjugado de oro coloidal en el rea de la muestra. Esta mezcla emigra a travs de la membrana por accin capilar y reacciona con el anti- HBsAg en la regin de prueba. Si la muestra contiene HBsAg se formar una banda coloreada en sta regin. Si no hay Ag en la muestra no se formar la lnea, indicando un resultado negativo. Una banda coloreada siempre se formara en la regin control lo que indica que el resultado de la prueba es vlido. OBJETIVO: El alumno conoce el procedimiento cualitativo para identificar HBsAg aplicando el mtodo inmunocromatogrfico a una muestra de suero, con el fin de evaluar a un donador y asegurar la confiabildad de una unidad de donacin. MATERIAL: Tubo al vaco sin anticoagulante Vial de reaccin para VIH y HCV Pipeta Pasteur Tubo de ensaye 13X100 Gradilla REACTIVOS: Suero Problema
Solucin de lavado para VIH y HCV

PROCEDIMIENTO: 1.- No abrir los sobres sellados hasta que se est listo para la prueba. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente. 2.- Sacar el cartucho de su sobre y colocarlo en una superficie seca. 3.- Identificar los cartuchos para cada muestra o control. 4.- Colocar tres gotas de muestra o control (con el gotero proporcionado) en el pocillo S. 5.- Interpretar resultados a los 15 minutos exactos.

INTERPRETACION: POSITIVO: Tanto la banda de prueba como la banda control se colorea de rojo prpura. NEGATIVO: Solo la banda control aparece de color rojo prpura en la membrana. INVALIDO: siempre tendr que haber una banda color rojo prpura en la regin de control independientemente del resultado de la prueba. Si la banda control no se observa la prueba se considera invlida. Repetir la prueba empleando un nuevo cartucho.

C T Positivo

C T

C T Negativo

C T Invlido

C T

ACTIVIDAD: 1.- Qu recomendaciones se hace para utilizar sangre total en ste procedimiento? 2.- Qu es el HBsAg? 3.- Qu ventajas ofrece una tcnica de ELISA sobre una inmunocromatografa? 4.- Describe las variantes del procedimiento de ELISA y esquematiza el Fundamento de cada uno.

PRACTICA 11

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA

FUNDAMENTO: Los anticuerpos incompletos se unen fcilmente con los sitios antignicos de los eritrocitos revistindolos pero sin dar muestra de aglutinacin, los Ac son antiglobulnicos (suero de Coombs) los eritrocitos revestidos IN VIVO, con un isoanticuerpo incompleto (anti-Rh, anti-Kell, anti-Duffy) resulta en una aglutinacin de stos eritrocitos. OBJETIVO: El alumno aprende y comprende la tcnica, con el fin de identificar una muestra de paciente sensibilizado y conozca as como sus implicaciones clnicas. MATERIAL: REACTIVOS: Tubo al vacio con EDTA Muestra problema anticoagulada Tubos de ensaye 13X100 Eritrocitos control Rh pos y neg al 2% Pipeta Pasteur con bulbo Suero anti-D dil. 1:20 Pipeta volumtrica de 10 ml Suero de Coombs Incubadora, termo block o termobao Solucin Salina Fisiolgica (SSF) Cronmetro Centrfuga MUESTRA PROBLEMA: Eritrocitos lavados (generalmente de un lactante materno sensibilizado, o de paciente politransfundido). Se prepara en suspensin al 2% de eritrocitos. Agregar en un tubo de ensaye rotulado como problema: 7 ml de SSF mas de 5 a 10 gotas de la muestra sangunea. Mezclar y centrifugar a 1500 RPM durante 1 min. Decantar cuidadosa y totalmente el sobrenadante y repetir el lavado 2 veces ms. Preparar la suspensin al 2% en medio salino mezclando 2 gotas de los eritrocitos problema lavados mas 5 ml de SSF. REACTIVO ANTI-D DILUCIN 1:20: Mezclar 1 gota de Anti-D mas 1 ml de SSF.

PROCEDIMIENTO: CONTROL NEGATIVO

Anti-D Dil. 1:20 Eritrocitos Rh (-) 2% Eritrocitos Rh (+) 2% 1 gota 2 gotas -------------------

CONTROL POSITIVO
1 gota ------------------2 gotas

PROBLEMA
----------------------------------------------------------

Lavar 3 veces el sedimento agregando SSF a la mitad del tubo, centrifugar a 1500 RPM / 2 min y decantar lo mas posible. Suero de Coombs 2 gotas 2 gotas 2 gotas Eritrocitos Problema ----------------------------------2 gotas al 2 % Mezclar y centrifugar a 1000 RPM / 1 min. Observar presencia de aglutinacin macro y microscpicamente.

INTERPRETACION: Coombs Directo Positivo: Presencia de Aglutinacin Coombs Directo Negativo: Ausencia de Aglutinacin

ACTIVIDAD: 1.- Esquematiza los diferentes tipo de Inmunoglobulinas 2.- Esquematiza la reaccin Ag-Ac en la prueba de Coombs directa e indirecta 3.- Que clase de Inmunoglublinas son las que se encuentran presentes en el suero de Coombs? 4.- En que pacientes suele dar positiva sta prueba y por que? 5.- Antes de realizar un Coombs Directo que es lo primero que se debe verificar?

PRACTICA 8

PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

FUNDAMENTO: Los anticuerpos incompletos conocidos o desconocidos se unen fcilmente con los sitios antignicos de los eritrocitos revistindolos pero sin dar muestra de aglutinacin. Al adicionar suero con anticuerpos antiglobulnicos (suero de Coombs) estos forman un puente con los anticuerpos (globulinas) de los eritrocitos revestidos IN VITRO, con isoanticuerpos completos (anti-Rh, anti-Kell, anti-Duffy) presentes en el suero de la madre o eritrocitos transfundidos resultando la aglutinacin de los eritrocitos revestidos. OBJETIVO: El alumno aprende y comprende la tcnica para realizar la prueba de Coombs indirecta, a fin de identificar una sensibilizacin in-vivo por una reaccin de incompatibilidad previa al proceso, incrementando con esto sus conocimientos confirmando su desempeo en el banco de sangre. MATERIAL: Tubos de ensaye 13X100 Pipeta Pasteur con bulbo Pipeta volumtrica de 10 ml y 1 ml Incubadora, termo block o termobao Cronmetro Centrfuga REACTIVOS: Muestra del suero problema
Eritrocitos Rh pos al 2%

Suero anti-D dil. 1:20 Suero de Coombs Solucin Salina Fisiolgica (SSF)

MUESTRA PROBLEMA: Suero de la madre o del paciente politransfundido. ERITROCITOS CONTROL: Eritrocitos lavados Rh pos. Se prepara en suspensin al 2% de eritrocitos. Agregar en un tubo de ensaye rotulado como problema: 7 ml de SSF ms de 5 a 10 gotas de la muestra sangunea. Mezclar y centrifugar a 1500 RPM durante 1 min. Decantar cuidadosa y totalmente el sobrenadante y repetir el lavado 2 veces ms. Preparar la suspensin al 2% en medio salino mezclando 2 gotas de los eritrocitos control lavados ms 5 ml de SSF.

REACTIVO ANTI-D DILUSIN 1:20: Mezclar 1 gota de Anti-D ms 1 ml de SSF. PROCEDIMIENTO: Numere del 1 al 12 tubos 13X100. 2.- Deposite 0.1 ml de SSF en los tubos del 2 al 10. 3.- Aadir 0.1 ml de suero problema a los tubos 1 y 2. 4.-A partir del tubo 2, preparar la dilucin en razn progresiva doble tomando 0.1 ml de la mezcla del tubo 2 y pasarlo al 3, mezclar y tomar nuevamente 0.1 ml de la mezcla del tubo 3 y pasarlo al tubo 4 y as sucesivamente hasta el tubo 10, del cual se desechara el volumen correspondiente a 0.1 ml de la mezcla.
Tubos problema Control Positivo Control Negativo (del 1 al 10) Eritrocitos Rh (+) 0.1 ml a cada tubo 2 gotas 2 gotas Anti-D dil. 1:20 ---------------2 gotas ----------------Mezclar e incubar 60 min / 37 C los 12 tubos. Centrifugar 1 min / 1500 RPM, realizar la primera observacin para verificar la presencia de aglutinacin o hemlisis. Lavar 3 veces con SSF, centrifugando 1 min / 1000 RPM. Decantar lo ms posible. Suero de Coombs 1 gota 1 gota 1 gota Mezclar y centrifugar 1 min / 1000 RPM, realizar la segunda observacin buscando la presencia de aglutinacin.

INTERPRETACION: COOMBS INDIRECTO NEGATIVO: Sin aglutinacin en la 1 y 2 observacin COOMBS INDIRECTO POSITIVO: Con aglutinacin en la 2 observacin. ANTICUERPOS SALINOS POSITIVOS: Con aglutinacin en la 1 observacin.

ACTIVIDAD: 1.- A que hace referencia una prueba de Coombs Indirecta positiva?

2.- Qu diferencia hay en la interpretacin de un Coombs directo y uno Indirecto?

3.- Para que utilizas el suero Anti-D diluido 1:20 en sta prueba?

PRACTICA 9

PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD: PRUEBAS CRUZADAS

Importancia de las pruebas cruzadas y de la bsqueda de anticuerpos RESUMEN Las pruebas cruzadas y la bsqueda de anticuerpos son de suma importancia, ya que permiten que los antgenos y anticuerpos puedan ser detectados y estudiados en el laboratorio; nos ayudan a prevenir la transfusin de sangre incompatible, y proveen al paciente de mxima seguridad y beneficio. Antes de realizar cada procedimiento es muy importante contar con un excelente control de calidad, el cual nos permitir verificar todos los procesos y etapas que influirn en la deteccin de los anticuerpos. Las pruebas cruzadas normalmente se llevan a cabo en cuatro fases: lectura rpida, lectura de 37, lectura 37/Coombs, validacin con eritrocitos sensibilizados. El medio que rodea la prueba est muy relacionado con los potenciadores y con la fuerza inica que favorece la reaccin antgeno-anticuerpo, por lo que debe ser capaz de detectar anticuerpos activos a bajas temperaturas y diferenciar entre reacciones positivas verdaderas y falsas. La investigacin de anticuerpos irregulares libres en suero se debe realizar por lo menos con dos tcnicas. Una segunda tcnica puede ser un medio hiperproteico como albmina, o enzimas como bromelina o LISS, siendo esta ltima la ms eficaz. Prueba de compatibilidad La prueba cruzada mayor incluye tcnicas que permiten demostrarla ausencia de anticuerpos regulares e irregulares de importancia clnica en el suero del receptor contra eritrocitos del donador. La prueba cruzada menor detecta anticuerpos en el suero del receptor, particularmente cuando se pretende transfundir sangre total proveniente de un donador con antecedentes propiciadores de aloinmunizacin. (embarazos o transfusiones previas).

El auto testigo cosiste en poner en un tubo debidamente identificado suero del paciente y suspensin de glbulos rojos del mismo al 5%,incubado y ledo con los mismos pasos de la prueba cruzada. FUNDAMENTO: Las pruebas de compatibilidad son un procedimiento de Laboratorio que permite conocer si existe compatibilidad serolgica entre la sangre de una persona donante y la de un receptor. OBJETIVO: Que el alumno aprenda el procedimiento y comprenda el fundamento de la tcnica para las pruebas cruzadas, a fin de evidenciar las reacciones de incompatibilidad entre el donador y receptor y de sta manera dar un servicio de calidad aportando una unidad de sangre segura. MATERIAL: REACTIVOS: Tubos al vaco sin anticoagulante Sangre del Donador Tubos al vacio con EDTA Sangre del Receptor Gradilla Albmina 22% Tubos de ensaye 13X100 Bromelasa Pipeta Pasteur Suero de Coombs Pizeta con SSF Incubadora PROCEDIMIENTO: 1.- Verificar que las muestras estn etiquetadas: Donador y Receptor 2.- Lavar los eritrocitos 3 veces con solucin salina 3 minutos a 3400 rpm 3.- Se rotulan los tubos para llevar acabo las pruebas.
Fase I Ms Ma Mb ms ma gR donador 2g 2g 2g ------gR receptor ---------2g 2g Suero/Plasma ---------2g 2g donador Suero/Plasma 2g 2g 2g ------receptor Albumina al 22% ---3g ------3g Bromelasa ------3g ------Mezclar y centrifugar 15 seg a 3400 rpm. Observar presencia de aglutinacin o hemlisis. Para albumina y bromelasa centrifugar 45 segundos. mb ---2g 2g ------3g AT ---2g ---2g -------

Fase II

Fase III

Se dejan a Ta de 15 a 30 min Se incuba a 37C de 15 a 30 min. Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3400 rpm. Observar presencia de aglutinacin. Para albumina y bromelasa centrifugar 45 segundos. Lavar los eritrocitos de todos los tubas 3 veces con SSF 3 min a 3400rpm Suero de Coombs 2g 2g 2g 2g 2g 2g 2g Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3400 rpm. Observar presencia de aglutinacin. Si no hay aglutinacin o hemlisis, se agrega a cada tubo una gota de clulas sensibilizadas para verificar el consumo.

OBSERVAR: Se observa el sobrenadante en busca de hemlisis, despus agitando suavemente e inclinando el tubo para apreciar cualquier aglutinacin, por dbil que sea, se debe deshacer completamente el botn celular.

INTERPRETACION:

INCOMPATIBLE: En caso de observarse hemlisis o aglutinacin en cualquiera de las fases. (Pero se debe proceder a determinar el porque de la incompatibilidad). NOTA: Despus de agregar las clulas control, se deber apreciar una aglutinacin, de no ser as la prueba no se puede dar por vlida y tendr que repetirse. A los plasmas, plasmas frescos-congelados, y concentrados plaquetarios, se les deber correr la prueba menor.

VALORACION DE LAS REACCIONES CRUZADAS

 1.-Aglutinacion en todos los tubos. a) Incompatibilidad ABO: en este caso la aglutinacin ser particularmente importante en el tubo con suero a temperatura ambiente. b) Presencia en el suero de poliaglutinina. c) Contaminacin de los glbulos del donador. 2.- Aglutinacion en el tubo de suero a temp. ambiente solamente. Indica con toda probabilidad un anticuerpo en frio, por ejemplo aglutininas en frio de las infecciones virales. Este tipo de aglutinacin habitualmente carece de importancia siempre y cuando los otros tubos sean negativos. Es preciso estudiar el titulo y la especificidad de cualquier hemolisina de este tipo. 3._Aglutinacion en los tubos de albumina y de coombs. Casi seguramente se debe a un anticuerpo caliente. La sangre debe considerarse como incompatible.Debe estudiarse el titulo y la especificidad del anticuerpo. 4._Positividad de la prueba de Coombs solamente. Lo mas probable es que tambin se deba a un anticuerpo incompleto caliente (ejemplo anti-Kell) se considera la sangre como incompatible ACTIVIDAD: 1.- Describe cada una de las reacciones transfuncionales

Reacciones hemolticas Reaccin transfusional infecciosa Reacciones alrgicas Reacciones pirognicas Reaccin clnica

2.- Menciona que tipos de anticuerpos son detectados en las pruebas cruzadas.

3.- Identifica las condiciones y los factores que influyen en los resultados de las reacciones Ag-Ac

BIBLIOGRAFIA: DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO CLINICO por el laboratorio,

John Bernard Henrry, MASSON-SALVAT, Barcelona, Espaa. METODOS DE LABORATORIO, INTERAMERICANA, Mxico, D.F. Lynch Raphael, editorial

EL MANUAL DE MERCK DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICA, Editorial

OCEANO/CENTRUM, 9 EDICIN.

DIAGNSTICO CLNICO POR EL LABORATORIO, Tood-Sanford, SALVAT Editores, 6 Edicin, Barcelona, Espaa.