ManualdeFundamentosyTecnicasdeAnalisisdeAlimentos 6501

ANLISI S DE ALIMENTOS.
FUNDAMENTO S Y TCNICAS
INTRODUCCIN La qumica y el anlisis de los alimen tos son discipl inas muy ampl ias que se basan en los princip ios de la fisicoqumica, qumica orgnica, biologa y qumica anal tica. Los avances en estas ciencias realizad os en los siglos XIX y XX han tenido un efecto imp ort ante en la comprensi n de muchos aspectos de la ciencia y tecnologa de alimen tos y han sido decisivos en el mejoramiento de la cantidad, calidad y disp onibilidad del suministro de alimen tos a nivel mundial. El anlisis de alimentos es la disciplina que se ocupa del desarrollo, uso y estudio de los procedimientos analticos para evaluar las caractersticas de alimentos y de sus componentes. Esta informacin es crtica para el entendimiento de los factores que determin an las propiedades de los alimentos, as como la habilidad para producir alimentos que sean consistentemente seguros, nutritivos y deseables para el consumidor. Existen un nmero considerable de tcnicas analticas para determin ar una propieda d particular del alimento. De ah que es necesario seleccionar la ms apropiada para la aplicacin especfica. La tcnica seleccionada depender de la propiedad que sea medida, del tipo de alimento a analizar y la razn de llevar a cabo el anlisis. Las determinaciones que se realizan ms frecuentemente para conocer la composicin de los alimentos i ncluyen la determin acin de humedad, cenizas, extracto etreo (grasa cruda), protena total, fibra y carbohidratos asimilables, en un protocolo conocido como Anlisis Proximal. As mismo, dependiendo del objetivo del anlisis, resultan importantes las determinaciones relacionadas con la caracterizacin de algn grupo de nutrientes en particular, tal es el caso del anlisis de carbohi dratos en el que se podra considerar la diferenciacin de los que presentan poder reductor, del contenido total. En el mismo sentido se podran analizar las protenas solubles o considerar la caracterizacin de los lpidos extrados de un alimento. El objetivo de este documento es revisar los principios bsicos de los procedimientos comnmente empleados para el anlisis de los alimentos y establecer las principales ventajas y desventajas. Este documen to tiene sus inicios para el curso de laboratorio de anlisis de alimen tos de la licencia tura en Qumica de Alimen tos de la Facultad de Qumica, de la UNAM, con duracin de un semes tre, sin embargo ha evoluci onado para ser parte fundamen tal de la nue va asi gnatura Laboratorio de Alimen tos I y pretende ser un apoyo para cualquier asigna tura o
actividad que requie ra el anlisis de los componentes de los alimentos. Se hace hincapi en la comprensi n de los principi os qumicos y analticos fundamen tales en que se basan las relaci ones entre la composicin de los alimen tos y algunas de sus propiedades funcionales y nutricionales. Adems se introducen diversas tcnicas de laboratorio que son comunes en la investigacin bsica y aplicada en qumica y anlisis de alimentos. Una vez revisad os los concep tos tericos de los procedimien tos, en la prime ra parte del documen to, se presen tan los procedimien tos detallad os y por ltimo un condensado con la preparacin de algunas soluciones de imp ortantes para el adecuado desa rrollo e las experiencias experimentales. A travs de los aos en que se ha trabajado con este material, muchos estudian tes han efectuado con xito las determinaci ones que se describen y continuamen te sus resul tados son compa rados con los obtenid os, para los mism os alimentos, en laboratorios de investigaci n con personal capacitado.
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An?lisis de Alimentos. Fundame ntos y t?cnicas
INDICE
FUNDAMENTOS ............................................................................................................................. .1 1 DETERMI ACI DE HUMEDAD ................................................................................. 1 . 1.1 DEFINICIN DE HUMEDAD .................................................................................................1 1.2 MTODOS DE SECADO .......................................................................................................1 1.2.1 Mtodo por secado de estufa................................................................................... 2 . 1.2.2 Mtodo por secado en estufa de vaco .....................................................................3 1.2.3 Mtodo de secado en termobalanza .........................................................................3 1.2.4 Mtodo de destilacin azeotrpica ..........................................................................3 1.2.5 Mtodo de Karl Fischer. ..........................................................................................4 2 A ALISIS DE MI ERALES .............................................................................................. 7 . 2.1 DEFINICIN DE CENIZAS ....................................................................................................7 2.2 MTODO DE CENIZAS TOTALES..........................................................................................7 2.3 DETERMINACIN DE CENIZAS EN HMEDO. .......................................................................8 2.4 DETERMINACIN DE ELEMENTOS MINERALES ...................................................................9 2.4.1 Determinacin de cloruros (Mtodo de Mohr) ........................................................9 2.4.2 Determinacin de hierro (Mtodo AOAC 944.02) .................................................10 2.4.3 Determinacin de calcio (Mtodo AOAC 944.03). ................................................11 2.4.4 Determinacin de calcio (Mtodo )OM-187-SSA1/SCFI-2002)...........................11 3 A ALISIS DE LPIDOS ....................................................................................................13 . 3.1 MTODOS DE EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN ...............................................................13 3.1.1 Mtodo de Soxhlet ..................................................................................................13 3.1.2 Mtodo de Goldfish ................................................................................................14 3.1.3 Mtodo por lotes.....................................................................................................14 3.1.4 Mtodo de Bligh-Dyer ............................................................................................14 3.1.5 Mtodo de Rse-Gottlieb........................................................................................15 3.1.6 Mtodo de Gerber. .................................................................................................15 3.1.7 Mtodo de Mojonnier .............................................................................................15 3.2 CARACTERIZACIN DE LPIDOS ............................................................................16 3.2.1 Peso especfico .......................................................................................................16 3.2.2 ndice de refraccin ...............................................................................................16 3.2.3 ndice de saponificacin........................................................................................16 . 3.2.4 Material insaponificable ........................................................................................17 3.2.5 Colesterol ...............................................................................................................17 3.2.6 Determinacin de ndice de Yodo. (Mtodo de Wijs y Mtodo de Hanus.) ..........18 3.3 DETERIORO DE LIPIDOS. ..........................................................................................18 3.3.1 Acidez titulable .......................................................................................................18 3.3.2 Determinacin del ndice de Perxidos. (Mtodo volumtrico) ............................18 3.3.3 Determinacin de perxidos. Mtodo volumtrico-Micromtodo .........................19 3.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos (Mtodo colorimtrico) ...........................19
3.3.5 3.3.6 4
ndice de Kreis. ......................................................................................................19 ndice de TBA .........................................................................................................19
PROTE AS.........................................................................................................................20 4.1 DETERMINACIN DE PROTENAS ......................................................................................20 4.1.1 Mtodo de Kjeldahl ................................................................................................20 4.1.2 Absorcin a 280 nm................................................................................................21 4.1.3 Mtodo de Biuret ....................................................................................................22 4.1.4 Mtodo de Lowry....................................................................................................22 4.1.5 Mtodo turbidimtrico............................................................................................23 4.1.6 Unin de colorantes ...............................................................................................23 4.2 EXTRACCIN DE PROTENAS. (MTODO DE OSBORNE Y MENDEL). ..............................25 4.3 PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTENAS .............................................................25 4.3.1 Capacidad de gelificacin.....................................................................................25 . 4.3.2 Capacidad de emulsificacin .................................................................................25 4.3.3 Capacidad de espumado ........................................................................................26 4.3.4 Capacidad de retencin de agua............................................................................26
A ALISIS DE CARBOHIDRATOS.................................................................................. 28 5.1 CARBOHIDRATOS TOTALES ...................................................................................28 5.1.1 Mtodo de fenol-sulfrico ......................................................................................28 5.2 ANALISIS DE POLISACARIDOS ...............................................................................28 5.2.1 Extraccin selectiva de almidn ............................................................................28 5.2.2 Cuantificacin de almidn .....................................................................................29 5.2.3 Anlisis de pectinas ................................................................................................30 5.2.4 Determinacin de Fibra diettica ..........................................................................30 5.3 AZCARES EN SOLUCIN .................................................................................................31 5.3.1 Carbohidratos solubles totales...............................................................................31 5.3.2 Determinacin de carbohidratos reductores .........................................................32
PROCEDIMIE TOS...................................................................................................................34 6 DETERMI ACIO 6.1 6.2 6.3 6.4 7 DE HUMEDAD ................................................................................34 MTODO POR SECADO EN ESTUFA (NIELSEN, 2003)........................................................34 MTODO POR SECADO EN ESTUFA DE VACO (NIELSEN, 2003).........................................34 MTODO DE SECADO EN TERMOBALANZA (KIRK ET AL, 1996).......................................34 MTODO DE DESTILACIN AZEOTRPICA (NIELSEN, 2003) ............................................34 DE MI ERALES............................................................................. 36
DETERMI ACIO
7.1 MTODO CENIZAS TOTALES (CALCINACIN) (KIRK ET AL, 1996) ....................................36 7.2 MTODO CENIZAS TOTALES (DIGESTIN HMEDA) (NOM-117-SSA1-1994) .................36 7.3 DETERMINACIN DE MINERALES .....................................................................................36 7.3.1 Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996) ....36 7.3.2 Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr ()ielsen, 2003) .......37 7.3.3 Determinacin de Fe en las cenizas ()MX-F-503-1987) ......................................37 7.3.4 Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995) ............................37 8 A LISIS DE LPIDOS .....................................................................................................38
8.1 EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS .................................................38 8.1.1 Mtodo de Soxhlet (James, 1999) ..........................................................................38 8.1.2 Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000) ..................................................38 8.1.3 Mtodo por lotes.....................................................................................................39 8.1.4 Mtodo Mojonnier (James, 1999) ..........................................................................39 8.1.5 Mtodo Rose-Gottlieb (James, 1999).....................................................................40 8.2 CARACTERIZACION DE LPIDOS ........................................................................... 41 . 8.2.1 ndice de saponificacin ()ielsen, 2003) ...............................................................41 8.2.2 Material Insaponificable (AOAC Official method 972.28F) .................................41 8.2.3 ndice de yodo (Mtodo de Hanus) ()ielsen, 2003)...............................................41 8.2.4 Peso especfico (Aurand et al, 1987) .....................................................................42 8.2.5 ndice de refraccin (Aurand et al, 1987) ..............................................................42 8.2.6 Vitamina A. Mtodo de Carr-Price (Aurand et al, 1987) ......................................42 8.2.7 Colesterol (Kenny, 1952) .......................................................................................43 8.3 DETERIORO DE LPIDOS ..........................................................................................43 . 8.3.1 Acidez titulable ()ielsen, 2003) .............................................................................43 8.3.2 Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo volumtrico (AOAC Official Method 965.33) ......................................................................................................................43 8.3.3 Mtodo Volumtrico-Micromtodo (Crowe y White, 2001)...................................44 8.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo colorimtrico (Kirk et al, 1996) 44 8.3.5 ndice de Kreis (Holm y Greenbank, 1923) ...........................................................45 9 A LISIS DE PROTE AS .............................................................................................. 46 9.1 DETERMINACIN DE PROTENAS......................................................................... 46 . 9.1.1 Protena cruda. Mtodo de Kjeldahl (AOAC Official Method 2001.11)...........46 9.1.2 Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)................................................48 9.1.3 Mtodo de Biuret (Gornall et al, 1949).................................................................48 9.1.4 Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951)) .................................................................48 9.1.5 Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957) ...................................................................49 9.1.6 Unin a colorantes Mtodo de Bradford ()ielsen, 2003) ................................49 9.2 EXTRACCION DE PROTENAS (OSBORNE Y MENDEL, 1914)...................................49 9.2.1 A. Albminas .........................................................................................................49 9.2.2 B. Globulinas..........................................................................................................50 9.2.3 C. Prolaminas.........................................................................................................50 9.2.4 D. Glutelinas ..........................................................................................................50 9.3 PROPIEDADES FUNCIONALES ............................................................................... 50 . 9.3.1 A. Capacidad de gelificacin (Avanza y An, 2001)........................................50 9.3.2 B. Capacidad de emulsificacin (Fennema, 1993) .............................................51 9.3.3 C. Capacidad de espumado (Ahmedna et al, 1999) .............................................51 9.3.4 D. Capacidad de retencin de agua (Robertson et al, 2000)..............................51 10 A ALISIS DE CARBOHIDRATOS.............................................................................. 52 10.1 CARBOHIDRATOS TOTALES .................................................................................. 52 . 10.1.1 Mtodo del fenol-sulfrico (Dubois et al, 1956) ....................................................52 10.2 ANLISIS DE POLISACARIDOS .............................................................................. 52 . 10.2.1 Determinacin de fibra diettica (985.29) .............................................................52
10.2.2 ALMID) ..............................................................................................................53 10.2.3 A)LISIS DE PECTI)AS ()ielsen, 1998) ............................................................56 10.3 AZCARES EN SOLUCIN........................................................................................56 10.3.1 Preparacin de la muestra (Southgate, 1991) .......................................................56 10.3.2 Carbohidratos solubles totales...............................................................................57 10.3.3 Determinacin de carbohidratos reductores .........................................................57 10.4 OTRAS DETERMINACIONES ....................................................................................59 10.4.1 Determinacin de densidad calrica .....................................................................59 11 12 BIBLIOGRAFA. .............................................................................................................62 PREPARACI O DE SOLUCIO ES.............................................................................65 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 12.10 12.11 12.12 12.13 12.14 REACTIVO DE HANUS ......................................................................................................65 REACTIVO DE DNS..........................................................................................................65 REACTIVO DE BIURET......................................................................................................65 REACTIVO DE LOWRY .....................................................................................................65 REACTIVO DE FEHLING (JAMES, 1999) ............................................................................66 REACTIVO DE YODO (PARA DETERMINACIN CALORIMTRICA DE ALMIDN)..................66 ORTOFENANTROLINA AL 1% ...........................................................................................66 BUFFER DE ACETATOS PARA DETERMINACIN DE FE ......................................................66 ACIDO BRICO CON INDICADORES ...................................................................................66 REACTIVO COLORANTE AZUL BRILLANTE ...................................................................66 SOLUCIN DE CARREZ I ..............................................................................................66 SOLUCIN DE CARREZ II .............................................................................................66 SOLUCIN I/KI AL 3% .................................................................................................66 SOLUCIN DE CLORURO DE SODIO ALCOHLICA ..........................................................66 A EXO .........................................................................................................................................65
Antolog?a de Fundamentos
FUNDAMENTOS
1 DETERMINACIN DE HUMEDAD
1.1 Definicin de humedad Todos los alimen tos, cualquie ra que sea el mtodo de indus trializaci n a que hayan sido sometidos, contienen agua en mayor o menor proporcin. Las cifras de contenido en agua varan entre un 60 y un 95% en los alimen tos naturales. En los tejidos vegetales y animales, puede decirse que existe en dos formas generales: agua libre Y agua ligada. El agua libre o absorbida, que es la forma predominan te, se libera con gran facilidad. El agua ligada se halla combinada o absorbida. Se encu entra en los alimentos como agua de cristalizacin (en los hidratos) o ligada a las protenas y a las molcul as de sac ridos y absorbida sobre la supe rficie de las partculas coloidale s. (Hart, 1991) Existen varias razones por las cuales, la mayor a de las industrias de alimentos determinan la humed ad, las principal es son las siguientes: a) El comprador de materias primas no desea adqui rir agua en exceso. b) El agua, si est presente por encima de ciertos niveles, facilita el desa rrollo de los microorganismos. c) Para la man tequilla, margarina, leche en polvo y queso est seal ado el mximo legal. d) Los materiales pul verulen tos se aglomeran en presencia de agua, por ejemplo azcar y sal. e) La humedad de trigo debe ajustarse adecuad amen te para facilitar la molienda. f) La can tidad de agua presen te puede afectar la textura. g) La determinaci n del contenido en agua represen ta una va sencilla para el control de la concen tracin en las distintas etapas de la fabricacin de alimentos. 1.2 Mtodos de secado Los mtodos de secado son los ms comun es para valorar el contenido de humedad en los alimentos; se calcula el porcentaje en agua por la perdida en peso debida a su eliminaci n por calen tamien to bajo condici ones normalizadas. Aunque estos mtodos dan buen os resultados que pueden interpretarse sobre bases de comparacin, es preciso tener presen te que a) algunas veces es difcil eliminar por secado toda la humedad presente; b) a cierta tempe ratura el alimen to es susceptible de descomponerse, con lo que se volatilizan otras sustancias adems de agua, y c) tambin pueden perderse otras materias voltiles apar te de agua. (Kirk et al, 1996)
1.2.1 Mtodo por secado de estufa La determinaci n de secado en estufa se basa en la prdida de peso de la mues tra por evaporacin del agua. Para esto se requie re que la mues tra sea trmicamen te estable y que no contenga una cantidad significa tiva de compues tos voltiles. El principio operacional del mtodo de determinaci n de humed ad utilizando estufa y balanza analtica, incluye la preparacin de la muestra, pesad o, secado, enfriado y pesado nue vamen te de la mues tra. (Nollet, 1996). Notas sobre las determinaci ones de humedad en estufa. 1. Los produc tos con un elevado contenido en azca res y las carnes con un contenido alto de grasa deben deshid ratarse en estufa de vaco a temperaturas que no excedan de 70C. 2. Los mtodos de deshid ratacin en estufa son inadecuad os para produc tos, como las especias, ricas en sustancias voltiles distintas del agua. 3. La eliminaci n del agua de una en la fase de vapor sea inferior necesa rio cierto movimien to del parcialmen te la ventilacin y en corriente de aire seco. mues tra requiere que la presin parcial de agua a la que alcanza en la muestra; de ah que sea aire; en una estufa de aire se logra abriendo las estufas de vaco dando entrada a una lenta
4. La tempe ratura no es igual en los distintos pun tos de la estufa, de ah la conveniencia de colocar el bulbo del termmetro en las proximidades de la mues tra. Las variaci ones pueden alcanzar hasta ms de tres grados en los tipos antiguos, en los que el aire se mue ve por conveccin. Las estufas ms modernas de este tipo estn equipadas con eficaces sistemas, que la tempe ratura no varia un grado en las distintas zonas. 5. Muchos produc tos son, tras su deshidratacin, bastante higroscpicos; es preciso por ello colocar la tapa de mane ra que ajuste tanto como sea posible inmedia tamen te despus de abrir la estufa y es necesa rio tambin pesar la cpsula tan pronto como alcance la temperatura ambiente; para esto puede precisa rse hasta una hora si se utiliza un desecad or de vidrio. 6. La reaccin de pardeamien to que se produce por interacci n entre los amin ocidos y los azcares reduc tores libera agua durante la deshidratacin y se acelera a tempe raturas elevadas. Los alimentos ricos en protenas y azcares reduc tores deben, por ello, deseca rse con precauci n, de preferencia en una estufa de vaco a 60C. (Hart, 1991)
1.2.2 Mtodo por secado en estufa de vaco Se basa en el principio fisic oqumico que relaci ona la presin de vapor con la presin del sistema a una tempe ratura dada. Si se abate la presin del sistema, se abate la presi n de vapor y necesa riamente se reduce su pun to de ebullici n. Si se sustrae aire de una estufa por medio de vaco se incremen ta la velocidad del secado. Es necesa rio que la estufa tenga una salida de aire constante y que la presin no exceda los 100 mm Hg. y 70C, de mane ra que la mues tra no se desc omponga y que no se evaporen los compues tos voltiles de la muestra, cuya presin de vapor tambin a sido modificada (Nollet, 1996). 1.2.3 Mtodo de secado en termobalanza Este mtodo se basa en evaporar de mane ra continua la humedad de la mues tra y el registro continuo de la perdida de peso, hasta que la mues tra se site a peso constante. El error de pesada en este mtodo se minimiza cuando la mues tra no se expone constantemen te al ambiente (Nollet, 1996). 1.2.4 Mtodo de destilacin azeotrpica El mtodo se basa en la destilaci n simul tnea del agua con un lquido inmisci ble en proporciones constantes. El agua es destilada en un lquido inmis cible de alto pun to de ebullici n, como son tolueno y xileno. El agua destilada y condensada se recolecta en una trampa Bidwell para medir el volumen (ver Fig. 1) (Nollet, 1996).
Fig. 1. Diagrama de destilaci n azeotrpica
Notas sobre los procedimien tos de destilaci n con disolvente. 1. Se recomienda emp lear los siguien tes disolventes: Disolventes Tetracloruro de carbono Benceno Metil ciclohexano Tolueno Tetracloroetileno Xileno P. ebull icin (C) 77 80 100 111 121 137-140
2. La Asociacin Americana de Comercio anal ticos, recomienda el uso de benceno en como pimien tos rojos, cebollas deshidratadas, en azca res y otras sustancias que pueden tempe ratura de ebullici n de tolueno.
Especias, en sus mtodos oficiales lugar de toluen o, con produc tos tales ajos desh idratados, etc., que son ricos desc omponerse, libe rando agua, a la
3. Es preciso limpiar la tot alidad del aparato, cada vez que se utilice, con cido sulf rico-dicromato, enjuagarlo prime ro con agua y luego con alcohol y, finalmente, secarlo. 4. Debe calib rarse el colector por sucesi vas destilaci ones con tolueno de cantidades de agua medid as con precisi n. Las lecturas deben aproxima rse en centsimas de mililitro. 5. La eleccin del colector depende del volumen de agua que se espera recoger, del grado de precisi n requerido y de la facilidad con que el disolvente refluya. (Hart, 1991) 1.2.5 Mtodo de Karl Fischer. Es el nico mtodo qumico comnmen te usado para la determinaci n de agua en alimen tos que precisamen te se basa en su reactivo. Este reactivo fue desc ubierto en 1936 y consta de yodo, dixido de azufre, una amina (originalmen te se empleaba piridina sin emba rgo por cues tiones de seguridad y toxicidad se est reemplaz ando por imidaz ol) en un alcohol (ejemplo metanol).
Inicialmen te, el dixido de azufre reacci ona con el metanol para formar el ster el cual es neu tralizado por la base (1). El ster es oxidado por el yodo a metil sulfato en una reaccin que involucra al agua (2). Las reacci ones son las siguientes: (James, 1999) CH3OH + SO2 + RN [RNH]SO3CH3 H2O + I2 + [RNH]SO3CH3 +2RN [RNH] (SO4)CH3 + 2[RNH]I (1) (2)
Habi tualmen te se utiliza un exceso de dixido de azufre, piridina y metanol de manera que la fuerza del reactivo venga determinada por la concen tracin de yodo. Este reactivo es un poderoso deshid ratante, por lo que tanto la mues tra como el reactivo deben prot egerse contra la humedad del aire, cualquie ra que sea la tcnica usada. Se hace por titulaci n y estas pueden ser visuales o potenci omtricas. En su forma mas simple el mismo reactivo funci ona como indicados. La disoluci n mues tra man tiene un color ama rillo canario mien tras haya agua, que cambia luego a ama rillo cromato y despus a pardo en el momen to del vire. En su forma mas simple el mtodo potenci omtrico consta de una fuente de corriente directa, un restato, un galvanmetro o mic roampe rmetro y elect rodos de platino, dos cosas son necesa rias para la determinacin: una diferencia de potencial que nos de una corriente y el contacto del titulan te con el analito. (Hart, 1991) Este mtodo se aplica a alimen tos con bajo contenido de humedad por ejemplo frutas y vegetales deshid ratados, aceite y caf tostado, no es recomenda ble para alimen tos con alto contenido de humedad. (James, 1999)
Tabla 1. Compa racin entre los mtodos para determinar humedad Mtodo Ventajas Desventajas
Es un mtodo convencional Es conveniente Es rpido y preciso Se puede n acomo dar varias muestras Se llega a la temp era tura desead a mas rpidamente La temp era tura va fluctuar debido al tamao de la partcula, peso de la muestra, posicin de la mu estra en el horno, etc. Prd ida de sustancias voltiles durante el secado Descomposicin de la muestra, ejemplo: azcar. La eficiencia es baja para alimentos con alta humedad
Secad o en estufa
Secad o en estu fa de vaco
Destil acin aze otrpica
Se calienta a baja temp era tura y por lo tanto se previene la descomposicin de la muestra Es recomendable para muestras que cont engan compu estos voltiles orgnicos Calentamiento y evaporacin const ante y uniforme Determina el agua direc tamente y no por prd ida de peso El dispo sitivo es sencillo de manejar Toma poco tiempo Se previene la oxidacin de la muestra No se afecta la hum eda d del ambiente
Secad o en termobalanza
Es un mtodo semiautomtico y automtico La mu estra no es removida por lo tanto el error de pesada es mnimo Es un mtodo estndar para ensayos de humedad Precisin y exac titud ms altos que otros mtodos Es til para determinar agua en grasas y aceites previni endo que la mu estra se oxide Una vez que el dispositi vo se monta la determin acin toma pocos minutos
Baja precisin del dispositivo para medir vol umen de agua Los disolventes inmiscibles como tolu eno son inflamables Se puede regist rar altos residuos debido a la destil acin de componentes solubles en agua, como glicerol y alcohol Cualqui er impu rez a puede generar result ados errneos Es excelente para investigacin pero no es prctico
Karl Fischer
Los reac tivos deben ser RA para prepara r el reactivo de Fischer El pun to de equiv alencia de titulacin puede ser difcil de determinar El reactivo de Fischer es inestable y debe estandar izar se in situ. El dispositi vo de la titulacin debe protegerse de la humedad atmosfrica debido a la excesiva sensi bilidad del reactivo a la humedad. El uso de la piridina que es muy reactiva.
(Nollet, 1996)
ANALISIS DE MINERALES
2.1 Definicin de cenizas Las cenizas de un alimen to son un trmino analtico equi valen te al residuo inorgnico que queda despus de calcinar la materia orgnica. Las cenizas normalmen te, no son las mismas sustancias inorgnicas presen tes en el alimen to original, debido a las perdidas por volatilizaci n o a las interacciones qumicas entre los constituyentes. El valor principal de la determinaci n de cenizas (y tambin de las cenizas solubles en agua, la alcalinidad de las cenizas y las cenizas insolubles en cido) es que supone un mtodo sencillo para determinar la calidad de ciertos alimen tos, por ejemplo en las especias y en la gelatina es un inconvenien te un alto contenido en cenizas. Las cenizas de los alimen tos debe rn estar comprendi das entre ciertos valores, lo cual facilitar en parte su identificaci n. (Kirk et al, 1996) En los vegetales predominan los derivados de potasio y en las cenizas animal es los del sodio. El carbonato potsico se volatiliza apreciablemen te a 700C y se pierde casi por comple to a 900C. El carbonato sdico permanece inal terado a 700C, pero sufre prdidas conside rables a 900C. Los fosfatos y carbonatos reaccionan adems entre s. (Hart, 1991) Notas: a) Los produc tos que contienen mucha agua se secan prime ro sobre un plato elctrico caliente o al bao Mara. b) La conside racin principal es que el produc to no desp renda hum os. c) En general, la tempe ratura adecuada de la mufla son 500C. Sin emba rgo, los cloruros, pueden volatiliza rse a esta temperatura. d) Las cenizas se utilizan muchas veces para la determinaci n de constituyentes indi viduales, por ejemplo cloruros, fosfatos, calcio y hierro. (Kirk et al, 1996) Para la determinaci n de cenizas se siguen principalmen te 2 mtodos, en seco y va hmeda. 2.2 Mtodo de cenizas totales La determinaci n en seco es el mtodo ms comn para cuantificar la totalidad de mine rales en alimen tos y se basa en la desc omposici n de la materia orgnica quedando solamen te materia inorgnica en la mues tra, es eficiente ya que dete rmina tanto cenizas solubles en agua, insolubles y solubl es en medio cido.
En este mtodo toda la materia orgnica se oxida en ausencia de flama a una tempe ratura que flucta entre los 550 -600C; el material inorgnico que no se volatiliza a esta tempe ratura se conoce como ceniza. (Nollet, 1996) 2.3 Determinacin de cenizas en hmedo. La determinaci n hmeda se basa en la descomposicin de la materia orgnica en medio cido por lo que la materia inorgnica puede ser determinada por gravimet ra de las sales que precipi ten, y tambin por algn otro mt odo analtico para las sales que permanezcan en disoluci n acuosa o cida. Para la determinaci n hmeda se dan cenizas alcalinas, cidas y neu tras y esto se basa en el tipo de anin o catin ya sea metlico o complejo de tal forma hay mine rales como tartratos, citratos que producirn cenizas con un carcter alcalino. Es necesario tomar en cuen ta que tambin un ndice de alcalinidad de cenizas es mues tra del contenido de carbonatos en disoluci n acuosa. Las ventajas y desventajas de estos mtodos se mues tran en la tabla 2. (Nollet, 1996) Tabla2. Comparaci n entre mtodos para deter minar ceniz as totales Mtodo Ventaja Desventaja
1. Simple 2. No se req uiere atencin durante la generac in de cenizas 3. No se requi eren reactivos 4. Se puede n manejar muchas muestras 5. Es un mtodo estndar para la determin acin de cenizas 6. Se puede determin ar cualqui er tipo de materia inorgnica 1. Se requi ere alta temperatura 2. El equipo es caro 3. Hay prd idas por volatilizacin 4. Hay interacc iones entre min erales y recipientes. 5. Hay absorcin de elementos traza por recipientes de porce lana o slice 6. Poca utili dad para anlisis de Hg, As, P y Se 7. Calentamiento excesivo puede hacer ciertos componentes insolubles. 8. Hay una dificultad de manejo de cenizas por ser higroscpicas, sensibles a la luz, etc.
1. Relativamente no se requi ere alta temperatura 2. El dispositi vo es simple 3. La oxidacin es rpida 4. Se manti ene la disolucin acuosa lo cual es bueno para anlisis mineral. 5. El equipo no es caro 6. No hay volatilizacin de minerales
1. Se requi ere n altas canti dade s de materiales corrosivos. 2. Se requi ere n cidos explosivos 3. Se requi ere estandar izar los reac tivos 4. Las reacc iones son fumantes 5. Manejar sist emticamente varias mu estras no es sencillo 6. El proced imi ento es tedioso y gasta mucho tiempo.
2.4 Determinacin de elementos minerales El trmino element os mine rales es poco preciso porque en los minerales se encuentran elemen tos orgnicos como carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxgeno y azufre. Sirve para agrupar a aquell os elementos, en su mayor a metlicos, que se presen tan en cantidades min oritarias en los alimen tos, y que suelen determina rse como elementos ms que como compues tos especficos o grupos de compuestos. El nme ro de estos elemen tos que se encuentran en los alimen tos es muy considerable inclu yndose en el: silicio, calcio, magnesio, sodio, potasio, fsforo, azufre, cloro, hierro, alumini o, manganes o, flor, arsnico, cobalto, cobre, mercurio, molibden o, plomo, selenio, estroncio, zinc, yodo, mercurio y boro. En algunos casos estos elemen tos son naturales en los alimen tos mien tras que en otros casos son produc to de la contaminacin. Los mtodos de determinaci n ms comun es se basan en la titulacin complejomtrica con EDTA o algn otro quelan te y por gravimetra (para cationes metlicos). Hay variantes para elementos con sodio y potasio que no se pueden titular con EDTA, este mtodo es el mtodo de cloroplatinato de Lind o-Gladd ing. Este mtodo se basa en la insolubi lidad del perclorato en alcohol y en otros disolventes orgnicos. Si la determinaci n es cui dadosa el mtodo de cloroplatinato rinde resul tados muy precisos pero en la actualidad tienen a sustituirse por mt odos basad os en el descubrimiento reciente de la insolubi lidad del tetrafenilb orato de potasio o en la fotometra de llama. Para la determinaci n de fsforo se realiza su conversin a fosfomolibda to. Separado por filtracin el fosfom olibda to amnico puede disolverse en un exceso de lcali patrn que es luego titulado por retroceso con cido o en un exceso de amoniaco para precipi tar luego el fsforo como fosfato amnico magnsic o, que se incine ra y se pesa como pirofosfato magnsic o. Cuando se trata de trazas de fsforo se puede reducir el fosfomolibda to a azul de molibdeno y determinar colorimtricamente. Para determinar azufre libre se necesita su oxidaci n antes de la incineracin con objeto de determinar azufre como sulfato de bario y para ello se utiliza comnmen te perxido de sodio, nitrato de magnesio y cido perclrico (Hart, 1991). 2.4.1 Determinacin de cloruros (Mtodo de Mohr) El mtodo se utiliza para determinar iones cloruro y bromuro de metales alcalinos, magnesio y amonio. La valoracin se hace con soluci n patrn de nitrato de plata.
El mtodo se basa en la formaci n de un precipi tado ladrillo provenien te del cromato de plata formado a partir del precipi tado de cloruro de plata, una vez que todo el Cl- haya reacci onado con el nitrato de plata. (Nielsen, 1998) Cl-+ Ag+ 2 Ag+ +CrO4= AgCl (Precipi tado blanco) AgCrO4 (Precipi tado rojo ladrillo)
La solucin debe tener un pH neutro o cercano a la neu tralidad. Un pH de 8.3 es adecuado para la determinacin. 2.4.2 Determinacin de hierro (Mtodo AOAC 944.02) La ortofenan trolina reacci ona con el Fe 2+, originando un complejo de color rojo caracterstico (ferrona) que absorbe n otablemen te en las regiones del espec tro visible de alreded or de 505 nm. El Fe 3+ no presen ta absorcin a esa longitud de onda y debe ser reducido a Fe 2+ med iante un agente reduc tor apropiad o, como la hidroxilamina, (en forma de clorato para incremen tar su solubil idad). (Bouma ns et al, 1997) La reducci n cuan titativa de Fe 3+ a Fe 2+ ocurre en pocos minu tos en un medio cido (pH 3-4) de acue rdo a la siguien te ecuacin: 4 Fe 3+ + 2 NH 2OH 4 Fe 2+ +N2O + 4 H+ + H2O Despus de la reduc cin del Fe 3+ a Fe 2+, se da la formaci n de un complejo con la adicin de ortofenan trolina. En un medio acido la ortofenan trolina se encuen tra en su forma protonada como ion 1,10-fenan trolin (FenH+). La reaccin de complejacin puede ser desc rita por la siguien te ecuacin: (La estructura qumica del complejo se mues tra en la figura 2) Fe 2+ + 3 FenH + Fe(Fen)3
3+
+ 3 H+
Fig. 2. Estructura qu mica de la ferrona. Consiste en 3 molculas de OP (ortofenantrolina) alrededor de un tomo central de Fe. Los tomos de carbo no de la ferrona estn representados con sombr as grises. Los tomos de N estn represe ntados en blanco
2.4.3 Determinacin de calcio (Mtodo AOAC 944.03). Titulaci n con permanganato El Calcio se precipi ta a pH 4 como oxalato (si hay fosfato presente se puede eliminar con cido actico), posteriormen te el oxalato se disuelve en cido sulfrico libe rando cido oxlico el cual se titula con una soluci n valorada de perman gana to de potasio. (James, 1999) Las reacci ones involucradas son: 1. Precipi tacin del Calcio con Oxalato de Amonio. CaCl2 + (NH 4)2C2O4 2NH4Cl + CaC2O4 2. Liberacin del cido oxlico por la accin del cido sulf rico sobre el oxalato de calcio CaC2O4 + H2SO4 CaSO4 + H2C2O4 3. Titulaci n del cido oxlico con perman gana to de potasio 5H2C2O4 + 2KmnO4 + 3H2SO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 10CO2 2.4.4 Determinacin de calcio (Mtodo NOM-187-SSA1/SCFI-2002). Formaci n de complejo con EDTA. Cuando se aade a una mues tra conteniendo Calcio (o Magnesio), cido etilendiamin otetractico (EDTA) o su sal, los iones se combinan con el EDTA. Se puede determinar Calcio en forma directa, aadie ndo NaOH para elevar el pH de la muestra
entre 12 y 13 unidades, para que el magnesio precipi te como hidr xido y no interfiera, se usa adems, un indicad or que se combine solamen te con el calcio (azul de hidroxinaftol). En el anlisis de Calcio la mues tra es tratada con NaOH 4N para obtener un pH de entre 12 y 13, lo que produce la precipi tacin del magnesio en forma de Mg(OH)2. Ense guida se agrega el indicad or azul de hidroxinaf tol que forma un complejo de color rosa con el ion calcio y se procede a titular con solucin de EDTA hasta la aparicin de un complejo color prpura: Reacciones : Ca+2 + Mg+2 + NaOH (4N) --------->Mg (OH)2 + Ca+2 Ca+2 + Indicad or (azul hidroxinaftol) ------> [azul hidroxinaftol- Ca++] (color rosa) [azul hidroxinaf tol - Ca++] + EDTA --------> [ EDTA - Ca+2 ] + azul hidroxinaftol (color prpura)
3 ANALISIS DE LPIDOS Los lpidos, junto con las prot enas y carbohidratos, constituyen los principales componentes estructurales de los alimen tos. (Nielsen, 1998). Los lpidos se definen como un grupo heterogneo de compues tos que son insolubl es en agua pero solubles en disolventes orgnicos tales como ter, cloroformo, benceno o acetona. Todos los lpidos contienen carbn, hidrg eno y oxigeno, y algunos tambin contienen fsforo y nitrg eno (Aurand et al, 1987). Los lpidos comprenden un grupo de sustanci as que tienen propiedades comunes y simili tudes en la composicin, sin emba rgo algunos, tales como los triacilgliceroles son muy hidrofbicos. Otros, tales como los di y monoacilgliceroles tienen movilidad hidrofbica e hidroflica en su molcula por lo que pueden ser solubles en disolventes relativamente polares (Nielsen, 1998) 3.1 Mtodos de extraccin y cuantificacin El contenido total de lpidos se determina comnmen te por mtodos de extraccin con disolventes orgnicos (por ejemplo Soxhlet, Goldfish, Mojonnier), sin emba rgo tambin puede cuantifica rse por mtodos de extracci n que no incluyen disolventes (por ejemplo, Babcock, Gerber) y por mt odos instrumen tales que se basan en propiedades fsicas o qumicas de los lpidos (por ejemplo, infrarrojo, densidad y absorcin es rayos X) (Nielsen, 2003). 3.1.1 Mtodo de Soxhlet
Es una extracci n semicontinua con un disolvente orgnico. En este mtodo el disolvente se calienta, se volatiliza y conden sa goteando sobre la mues tra la cual queda sume rgida en el disolvente. Posteriormen te ste es sifoneado al matraz de calentamiento para empezar de nuevo el proceso. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso (Nielsen, 2003)
Fig. 3. Esquema de extraccin Soxhlet.
3.1.2 Mtodo de Goldfish Es una extracci n continua con un disolvente orgnico. ste se calienta, volatiliza para posteriormen te condensa rse sobre la mue stra. El disolvente gotea continuamen te a travs de la mues tra para extraer la grasa. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso entre la mues tra o la grasa removida (Nielsen, 2003)
Fig. 4. Equ ipo de extraccin Goldfish
3.1.3 Mtodo por lotes Este mtodo hace uso de la solubilidad intrnseca de la sustancia a separar; es claro que un compu esto no polar es soluble en un disolvente no polar (Hoffman, 1989). La extraccin se realiza en fro para evitar el dao del material lipdico y por lotes para incremen tar la eficiencia. 3.1.4 Mtodo de Bligh-Dyer El mtodo de Bligh-Dyer as como su modificaci n por Hans on y Olley proporciona un mtodo rpido para la extraccin de lpidos de tejidos y productos alimen ticios que contienen una cantidad significa tiva de agua. El mtodo se basa en la homogenizacin
de la mues tra con cloroformo, metanol y agua en proporciones tales que se forme una sola fase miscible con el agua de la mues tra. Al aadir alcuotas de cloroformo y agua se logra la sepa racin de fases. El material lipdico se encuen tra en la fase no acuosa, mien tras que el material no lipdico se encuen tra en la fase acuosa. Los lpidos se pueden extraer de dos gramos de mues tra seca hasta veinte gramos de mues tra hmeda. El contenido de agua de la mues tra se ajusta a diecisis milili tros para conservar la proporcin de cloroformo, metanol y agua la cual es esencial si se pretende una sepa racin de fases y una extraccin cuan titativa de lpidos. La ventaja de este procedimien to es que las etapas de filtrado y lavado son eliminadas. Sin emba rgo no es un mtodo muy cuan titativo y tiene un elevado margen de error para mues tras secas de cereales (Rossell y Pritcha rd, 1991) 3.1.5 Mtodo de Rse-Gottlieb. De acue rdo a este mtodo, la sepa racin de la grasa es logr ada por amoniaco y etanol con un posterior efecto de deshid ratacin sobre los fosfolpidos. La grasa es disuel ta en ter recin destilado y se aade algo de petrleo de tal suerte que se sepa ren algunos compues tos no lipdicos que se puedan enc ontrar en la fase etrea. Esta mezcla es comple tamen te inmis cible en agua de manera que median te una extracci n adecuada es simple dejar la grasa en la fase etrea y el residuo graso es pesado. Este mtodo es particular para leche fresca que no contiene cidos grasos libres, los cuales en disoluci n alcalina forman sales de amonio y esto es insoluble en ter. Esta es la razn por la cual esto no se aplica a quesos, los cuales si tienen cidos grasos libres. (Boekenoogen, 1964) 3.1.6 Mtodo de Gerber. ste, as como los dems mtodos volumt ricos presen tan un carcter un tanto cuanto emprico ya que varios factores afectan la gravedad especfica de la grasa separada, variaci ones propias de la grasa, cidos grasos presen tes, solubilid ad de la grasa en los disolventes, etc. Con estos mtodos volumt ricos la mues tra se sita en un butirmetro y se desc ompone utilizando cidos o lcalis de mane ra que la grasa es liberada, esta se sepa ra por mt odos mecnic os (centrifuga) y se colecta en el cuello calibrado. (Boekenoogen, 1964) 3.1.7 Mtodo de Mojonnier La grasa es extrada con una mezcla de ter etlico y ter de petrleo en un matraz de Mojonnier, la grasa extrada se pone a peso constante y es expresada en porcentaje de grasa por peso. La prueba de Mojonnier es un ejemplo de extraccin discontinua con
disolvente. Esta extraccin no requie re remover previamen te la humedad de la muestra. (Nielsen, 1998)
Fig. 5. Matraz de extraccin Mojonnier
3.2 CARACTERIZACIN DE LPIDOS
3.2.1 Peso especfico Es una determinaci n gravimt rica en donde un picn metro se llena con la mues tra de aceite y permanece en un bao a 25C por 30 min, se seca y pesa. Se expresa el peso especifico como la relacin del peso del aceite con respec to al agua (g de aceite/g agua). (Aurand et al, 1987) 3.2.2 ndice de refraccin Se define como la relacin de la velocidad de la luz en el aire (tcni camen te un vaco) con respec to a la velocidad de la luz en el aceite. Se obtiene midiendo directamen te en un refractmetro a 20-25C para los aceites y a 40C para las grasas. (Nielsen, 1998) 3.2.3 ndice de saponificacin El ndice de saponificacin denota el peso de hidrxido potsico en mg que se requieren para saponificar un gramo del aceite o grasa. El aceite se saponifica calen tndolo con un exceso de lcali custico alcohlico. La can tidad de lcali consumida se calcula valorando por retroceso con cido clorhdrico. El ndice de saponificacin es inversamen te proporcional a la medida de los pesos molecula res de los cidos grasos de los glicridos presentes en el aceite o grasa. Como much os aceites dan ndices simila res, el ndice de saponificaci n es menos valioso que el
ndice de yodo cuando se trata de identificar un aceite desconocido. Notables excepci ones son los altos ndices del aceite de coco y el aceite de almend ra de palma (ambos utilizad os en la margarina) y de la grasa de mantequilla. (Pearson, 1993) CH 2-OOC -R - CH-OOC-R - CH2-OOC -R + 3 KOH CH 2-OH - CH-OH - CH2-OH (glicer ol) + 3 R-CO2-K 3.2.4 Material insaponificable La materia insap onificable consta de aquellas sus tancias contenidas en los aceites comerciales y grasas (dife rentes a las de bajo p. de ebullici n a los cidos libres y a la materia mine ral) que, despus de saponificar y extraer con ter dietlico, quedan sin volatiliza rse luego de secar a 80C. Inclu yen hidrocarburos y alcoholes de alto peso molecula r. L/a mayor a de los aceites y grasas contienen una pequ ea parte de materia insap onificable (normalmen te menos del 2 %). (Pearson, 1993) 3.2.5 Colesterol El mtodo qumico de Liebe rmann-Bu rchard para la determinaci n de colesterol en una mues tra lipdica se basa en el desa rrollo de una coloracin verde en presencia de anh drido actico y cido sulf rico concen trado con temp eratura, despus de 30 min de reaccin (Nollet, 1996). La intensidad de la coloracin es medida por absorcin en el espec trofotmetro a 620 nm. La intensid ad tiene una relacin lineal con la concentracin de colesterol entre 100 y 600g, se debe realizar una solucin control de colesterol de diferentes concen traciones para realizar una compa racin ( Kenny, 1952)
Fig. 6. Mecanismo de reaccin del colesterol con anhdr ido actico en medio cido (Reaccin L iebermann Burchard). El compuesto formado absorbe de 600-620 nm (Burke et al, 1974)
3.2.6 Determinacin de ndice de Yodo. (Mt odo de Wijs y Mt odo de Hanus.) El ndice de yodo de los lpidos depende de su grado de instauracin. La grasa disuelta se hace reacci onar con monobromuro de yodo en exceso. La can tidad de monobromuro de yodo que no se adiciona a los dobles enlaces oxida una disoluci n de yoduro a yodo, y ste se determina por valoracin con una disoluci n de tiosulfa to de sodio. La reaccin de adicin se lleva a cabo en oscuridad para evitar que se produzcan reacci ones laterales de radicales inducidos por la luz (y con ello un gasto apa rente de halgeno mayor). Dado que el reactivo halogenan te va preparado en actico glacial y es de concentracin aprox imada y variable debe r hacerse siempre un ensayo en blanco para calcular su equi valencia en yodo (Nielsen, 2003). Se expresa convenci onalmen te por el peso de yodo absorbido por cien partes en peso de materia grasa. La diferencia entre ambos mtodos es el agente halogenad o, en el Mtodo de Hanus el agente es IBr, preparado de la mezcla de I2 con Br2 en cido actico y en el Mtodo de Wijs el agente es ICl prepa rado de la mezcla de ICl3 con I2 en medio de cido actico. (Pearson, 1993)
3.3
DETERIORO DE LIPIDOS.
3.3.1 Acidez titulable La acidez titulable es una medida del contenido de cidos grasos libres en una muestra. Su clculo se basa en la masa molar de un cido graso o una mezcla de cidos grasos. Normalmen te se mide por titulaci n directa en la disoluci n y con indicad or visual. (Boekenoogen, 1964) R-CO OH + KOH R-COOK + H2O 3.3.2 Determinacin del ndice de Perxidos. (Mtodo volumtrico) Se define como los miliequi valentes (mEq) de perxido por kilogramo de grasa. Es una determinaci n volum trica de la cantidad de grupos perxidos e hidroperxidos. La cuan tificacin se basa en la reaccin del yoduro de potasio con los perxidos para liberar yodo, el cual es titulado con tiosulfato de sodio, empl eando almid n como indicad or (Nielsen, 1998).
Las reacci ones que se llevan a cabo son: ROOH + KI (exceso) ROH + KOH + I2 I2 + almidn + Na2S2O3 2NaI + almidn + Na2S4O6 (azul) (incoloro) 3.3.3 Determinacin de perxidos. Mtodo volumtrico-Micromtodo Tiene el mismo principio que el mt odo volum trico desc rito en el AOAC, es propues to por Crowe y White en 2001, donde demues tran que tiene una relacin lineal (r2= 0.998) adems de sensib ilidad y precisi n adecuadas emplea ndo solo el 10% de los reactivos qumicos necesa rios para el mtodo oficial. 3.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos (Mtodo colorimtrico) Este es un mtodo colorimtrico indirec to. Se basa en que a una mues tra que contenga perxidos se adici ona un reactivo de hierro (II); en la mues tra se llevar a cabo la oxidaci n electroqumica de hierro (II) a hierro (III) (Jiang et al, 1992)y ste ltimo ser cuan tificado por su reaccin de complejacin con tiociana to mostrando un color rojo caracterstico. (Kirk, 1991). Fe2+ + ROOH + Fe3+ 3+ + SCN - -----> [FeSCN]2+ Fe 3.3.5 ndice de Kreis. La florog lucina reacci ona en medio cido con las grasas oxidad as, dando una coloracin roja, cuya intensidad aumen ta con el deterioro, debido probablemen te a la presencia de de aldeh do mal nico o de aldeh do epihid rnico. (Aurand et al, 1987)) 3.3.6 ndice de TBA El cido tiobarbitrico (TBA por sus siglas en ingls) reacci ona con produc tos de oxidaci n secunda ria de los lpidos. El mal onaldehdo reacci ona con TBA para producir un compues to colorido se puede medir espec tofotomtricamen te. Debido a que no es especfica para el malonaldeh do algunas veces el resultado se report a como sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS).
4 4.1 Determinacin de protenas 4.1.1 Mtodo de Kjeldahl
PROTENAS
En el trabajo de rutina se determina mucho ms frecuen temen te la prot ena total que las protenas o amin ocid os indi viduales. En general, el procedimien to de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no protenas como las prot enas verdaderas (Aurand et al, 1987) El mtodo se basa en la determinaci n de la cantidad de Nitrgeno orgnico contenido en produc tos alimen tarios, compromete dos pasos consecutivos: a) La desc omposicin de la materia orgnica bajo calen tamien to en presencia de cido sulfrico concentrado. b) El registro de la can tidad de amoniaco obtenida de la muestra Durante el proceso de desc omposicin ocurre la deshid rataci n y carbonizaci n de la materia orgnica combinada con la oxidaci n de carbono a dixido de carbono. El nitrg eno orgnico es transf ormado a amoniaco que se retiene en la disolucin como sulfato de amonio. La recupe racin del nitrgeno y velocidad del proceso pueden ser incremen tados adici onando sales que abaten la tempe ratura de descomposici n (sulfato de potasio) o por la adicin de oxidantes (perxido de hidr geno, tetracloruro, persulfa tos o cido crmico) y por la adicin de un catalizad or. (Nollet, 1996) El mtodo de Kjeldahl consta de las siguien tes etapas: a) Digestin b) Destilacin
(rec ibiendo en HCl) (rec ibiendo en H3BO3)
Protena + H2SO4 CO2 + (NH 4)2SO4 + SO2 (NH 4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + NH3 + H2O NH 3 + H3BO3 NH4H2BO3
c) Titulacin
(si se recibi en HCl) (si se recibi en H3BO3)
NH4Cl + HCl + NaOH NH4Cl + NaCl + H2O NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl
En la mezcla de digestin se incluye sulfato sdico para aumen tar el pun to de ebullicin y un catalizad or para acelerar la reaccin, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el
destilado se retiene o bien por un cido normalizado y se valora por retroceso, o en cido brico y valora directamen te. El mt odo Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrgeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pea rson, 1993) Para convertir el nitrgeno a prot ena se emplea el factor de 6.25 el cual proviene de la conside racin de que la mayor a de las protenas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrgeno. factor = 6.25 100 g Pr otena 16 g)itrgeno algunos alimentos Factor 6.25 6.38 5.33 5.65 5.36 5.52 5.17 (Nielsen, 1998) =
Tabla 3. Factores de conversin de nitrgeno a prot ena para Alimento % N en protena Hue vo o carne 16.0 Leche 15.7 Trigo 18.76 Maz 17.70 Avena 18.66 Soya 18.12 Arroz 19.34
4.1.2 Absorcin a 280 nm. La mayor a de las protenas mues tran una absorcin a 280 nm., la cual se atribuye al grupo fenlico de la tirosina y al grupo indlico del triptofano. La cuantificaci n de protenas basada en la absorcin en la regin de UV, tiene la ventaja de que no es necesa rio utilizar reacti vos y la mues tra no se daa o dest ruye durante la determinacin. Se toma en cuen ta la absorcin del disolvente, ya que este puede absorber en la misma regin. Este mt odo sufre interferencias de compues tos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una compa racin con una prot ena estndar, de la que se debe conocer su composicin. (Nollet, 1996)
Fig. 6. Estructura qumica de los amin ocidos aromticos
4.1.3 Mtodo de Biuret El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formaci n de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presen ta un color violeta caracterstico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinaci n de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desp roto naci n de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimien to de un enlace coor dinado entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxigeno y de nitrgeno del pp tido (Ver Figura 7). Despus de la adicin del reactivo de cobre se requie re de tiempo para desa rrollar una coloracin de Biuret estable; es necesa rio c onside rar la posible influencia de amin ocid os libres que forman buffer en configuracin tris y amoniaco. (Nollet, 1996)
N O
2+
N O
R H O N
Cu
N H
Fig. 7. Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos
4.1.4 Mtodo de Lowry El mtodo de Lowry et al, 1951 combina la reaccin de Biuret con la reducci n del reactivo de Folin-Ciocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico) por la oxidaci n de tirosina, triptofano, cistena, cistina de las cadenas polipep tdicas (Nielsen, 1988). El proceso de oxido-reducci n se acompaa de la formaci n de un color azul caracterstico. Los quela tos de cobre en la estructura del pptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funci onales amino al cromforo cido. Este mtodo es til para determinar pequeas cantidades de protena en una disolucin. El desarrollo de color es
dependien te en gran cantidad del pH, que se debe man tener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996)
Fig. 8. Esquema general de las reacci ones que se llevan a cabo en el mtodo de Lowry 4.1.5 Mtodo turbidimtrico La turbidez producida cuando una protena se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (cido tricloroactico 3-10%, cido sulfosaliclico y ferrocianu ro de potasio en cido actico) para protenas en bajas concentraciones se puede utilizar como un ndice de la concen tracin de protenas. Las tcnicas turbidi mtricas son rpidas y convenien tes, sin emba rgo las principales desventajas que presentan es que las prot enas difie ren en la velocidad de precipitacin as como no permiten dife renciar entre prot enas y compues tos insolubles en cidos tales como cidos nucleicos. (Layne, 1957) 4.1.6 Unin de colorantes Controlando el pH y la fuerza inica del medio los grupos funci onales cidos y bsicos de las prot enas pueden interactuar con grupos orgnic os de carga opues ta. Al realizarse la uni n se presenta coloracin o bien un cambio de sta. Comnmen te se usan colorantes sulf onados los cuales reacci onan a pH cido con el grupo -amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidaz ol de la histidina y un nme ro limi tado de amino terminales. (Nollet, 1996)
Tabla 4. Compa racin entre los mtodos usad os para determinaci n de protenas
Mtodo Ventajas Es apropi ado para varios tipos de productos Su alta confiabili dad y disponibilidad Esta incluido en los mtodos aprobados por las organizaciones internacionales Desventajas Llega haber interfere ncia de compu estos nitrogenados no proteicos Durante la digestin se produce de masiado humo Uso de catalizad ores caros o txicos Baja sensibilidad Tarda demasiado tiempo La interfere ncia de otros compu estos que absorban en UV Se necesita usar muestras limpi as y lmparas relativamente nuevas
Kjeldahl
Absorcin a 280nm
Biuret
Rpida y no destructiva No se necesitan reactivos Alta sensibilidad Baja dependencia de la respu esta de la seal a la composicin del aminocido Baja interfere ncia de cidos nucleicos y nucletidos No hay interfere ncia de amino cidos libres Pequea influencia de la composicin del amino cido en el desarrollo de color La operac in es simple y se puede manejar nmero grande de muestras Alta sensibilidad Fcil de operar Fcil de manejar un gran num ero de muestras
Interfere ncia de amoniaco, buffer, detergentes Baja sensibilidad
Lowry
Dependencia del color con la comp osicin del aminocido Interfieren un buen nmero de compuestos Inestabilidad del reactivo Folin-Ciocalteau a pH alcalino La curva estndar no es lineal para altas concentraciones de protenas por lo tanto es necesario diluir mucho antes de medir
(Nollet, 1996)
4.2 Extraccin de protenas. (Mtodo de Osborne y Mendel). El mtodo se fundamen ta en la relacin estructura-solubilidad de las protenas. Por ejemplo, se sabe que la zena que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones alcalinas diluid as, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgnicas. Las glutelinas por ejemplo es insoluble en agua, en soluci ones salinas y en alcohol, y bastante soluble en sosa y potasa. Es imp ort ante notar que la mayor a de nitrgeno provenien te de protenas es soluble en alcohol y en disoluci ones alcalinas. Las globulinas, alb minas y prolinas son solubles en disoluci ones alcalinas diluidas. (Osborne, 1914)
4.3 Propiedades funcionales de las protenas 4.3.1 Capacidad de gelificacin Cuando las prot enas desna turalizadas se agregan para ordenada, al proceso se le den omina gelificacin. formar una red proteica
La gelificacin es una propiedad funci onal muy imp ort ante de algunas prot enas, se utiliza, no slo para formar geles slidos viscoelsticos, sino tambin para mejorar la absorcin de agua, los efectos espesan tes, la fijacin de partculas (adhesi n) y pata estabilizar emulsi ones y espumas. Los mecani smos y las interacci ones responsables de la formacin de las redes tridimensi onales proteicas son el desplie gue y se desna turaliza antes de la interacci n y agregacin ordenada protena-p rotena. La formaci n de las redes proteicas se considera el resul tado de un balance entre las interacci ones protena-protena y protenadisolvente (agua) y entre las fuerzas atractivas y repulsi vas entre cadenas polipeptdicas adyacen tes. Entre las fuerzas atractivas implicadas se encu entran las interacciones hidrofbicas (potenciadas por las tempe raturas elevadas) elec trostticas (como los puen tes de calcio (II) y otros cationes divalentes), los puen tes de hidrgeno (potenciados por el enfriamien to) y los enlaces disulfuro. (Fennema, 1993) 4.3.2 Capacidad de emulsificacin La Capacidad de emulsificacin es el volumen de aceite que puede ser emulsif icado por cada gramo de protena, antes de que se produzca la inversin de fases. Las caractersticas de una emu lsin y los resul tados obtenid os en los dos tipos de ensa yos menci onados se ven influid os por ml tiples factores: tipo y geomet ra del equipo utilizad o, intensidad del input de energa, velocidad de adicin del aceite,
volumen de la fase grasa, tempe ratura, pH, fuerza inica, presencia de azcares y agentes de supe rficie de bajo peso molecular, exposicin al oxgeno, tipo de grasa, concen tracin de las protenas solubles. (Fennema, 1993) 4.3.3 Capacidad de espumado Las espumas suelen ser dispe rsiones de burbujas de gas en una fase continua, lquida o semis lida, que contiene un agente con actividad de supe rficie, soluble. En muchos casos, el gas es aire (y en ocasi ones dixido de carbono) y la fase continua una disoluci n o suspensi n acuosa de protenas. Se puede producir espuma batiendo o agitando una disoluci n proteica en presencia de abundan te fase gaseosa. La formaci n de espuma requie re la difusi n de las protenas solubles hacia la interfase aire/ agua, donde deben desple garse, concentrarse y extende rse rpidamen te, para rebajar la tensi n interfasial. El desple gamiento previo de las prot enas globula res, a travs de un calen tamiento moderado, la exposicin a agentes desnaturalizan tes, como sustanci as reduc toras de los grupos disu lfuro, o la proteolisis parcial, mejoran la orientacin en la interfase y proporcionan a las protenas una mayor capacidad de formaci n de espuma. Para estabilizar una espuma es preciso formar una pelcula proteica, impe rmeable al aire, gruesa, elstica, cohesi va y continua en torno a cada burbuja. La capac idad de espumado se define como los mili litros de espuma por milili tro de lquido. (Fennema, 1993) 4.3.4 Capacidad de retencin de agua Se determina la cantidad de agua necesa ria para lograr un estado de saturaci n de la prot ena (can tidad mxima de agua retenida, medida por centrifu gacin). En este mtodo se mide tanto el agua ligada (agua de hidratacin, no congelable) como el agua capilar, retenida fsicamen te entre las molculas proteicas. La concen tracin proteica, el pH, la tempe ratura, el tiemp o, la fuerza inica y la presencia de otros componentes afectan a las fuerzas que toman parte en las interacci ones protena-protena y protena-agua. La absorcin total de agua aumen ta con la concen tracin proteica. Los cambios de pH, a travs de su influe ncia sobre la ionizacin y la magnitud de la carga neta de la molcula proteica, alteran las fuerzas interac tivas, atractivas o repulsi vas, de la prot ena y modifican su aptitud para asociarse con el agua.
La fijacin de agua por las protenas descie nde generalmen te a medida que se eleva la tempe ratura, debido a la dismin ucin de los puen tes de hidrgeno. El calentamiento provoca la desna turalizaci n y la agregacin, pudiendo esta ltima reducir el rea supe rficial y el nmero de grupos amino polares disp onibl es para fijar agua. Por otro lado, cuando se calien tan prot enas con una estructura muy compa cta, la disociaci n y el desple gamien to ocasionados pueden exponer enlaces peptdicos y cadenas laterales polares previamen te ocultos, lo que aumen ta la fijacin. El tipo y la concent racin de iones ejercen un conside rable efecto sobre la abso rcin de agua. Gene ralmen te, se establece una competencia en la interacci n entre el agua, la sal y las cadenas laterales de los amin ocidos. (Fennema, 1993)
ANALISIS DE CARBOHIDRATOS
5.1 CARBOHIDRATOS TOTALES 5.1.1 Mtodo de fenol-sulfrico Este mtodo p ropuesto por Dubois et al en 1956 se fundamen ta en que los carbohidratos son particula rmen te sensible a cidos fuertes y altas tempera turas. Bajo estas condici ones una serie de reacci ones complejas toman lugar empezando con una deshid ratacin simple, si se contina el calentamien to y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mism os y con otros subproductos para producir compues tos coloridos producto de la condens acin de compuestos fenlicos y con heterocicl os con el nitrg eno como heterotomo. La condens acin ms comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azca res como oligosacridos y polisac ridos pueden recordando que stos bajo hidrlisis cida producen monosacridos. ser determinados,
La forma en que procede la reaccin no es estequi omtrica y depende de la estructura del azca r, por lo tanto se realiza una curva patrn. (Nielsen, 1998)
5.2 ANALISIS DE POLISACARIDOS 5.2.1 Extraccin selectiva de almidn Los dos tipos de molculas que se pueden enc ontrar en el almid n difieren apreciablemen te en sus solubilidades en disolventes acuosos, por ejemplo, la extraccin en agua caliente remo ver una parte conside rable de amil osa y dextrinas, dejando una parte de amil opectina. (Southgate, 1991) 5.2.1.1 Con cloruro de calcio La extraccin con cloruro de calcio ha sido utilizada ampliam ente en el anlisis de almid ones en cereales por mtodos polarimetritos, dando resul tados reproducibles. Otros polisac ridos son solubles en este reactivo y es necesa rio tener cuidado en la aplicaci n de este mtodo a otros tipos de alimen tos. (Southgate, 1991) 5.2.1.2 Con cido perclrico El almid n se extrae de una mues tra seca con cido perclrico y se precipi ta como complejo yodurado el cual, se descompone antes de que se hidrolice el almidn. (Southgate, 1991)
5.2.1.3 Con etanol y cido perclrico El mtodo se diseo originalmen te para cereales y envuel ve la extraccin de azucares libres con etanol acuoso y la extraccin del almid n con cido perclrico del residuo, con mtodos como el de antrona. (Southgate, 1991) 5.2.1.4 Con dimetil sulfxido (DMSO) El almid n se dispe rsa en DMSO y luego se convierte cuan titativamen te en D-glucosa con -amilasa termoestable, lle vando a cabo la polimerizaci n y de polime rizaci n del almidn. Una glucoamilasa comple ta la accin de la -amilasa para determinar la D-glucosa usando un reactivo contiene una parte incolora que se oxida a un compues to colorido por medio del peroxido de hidrogeno proveniente de la glucosa. (Nielsen, 1998)
5.2.2 Cuantificacin de almidn 5.2.2.1 Por hidrlisis cida directa La hidrlisis cida del almid n da un rendi miento casi terico de glucosa y este proceso ha sido el principio de varios mt odos analticos. La fuerza del cido utilizado para la hidr lisis puede variar pero se sabe que una disoluci n 0.2 M de cido sulfrico por 4 horas en reflujo convierte el almid n en glucosa de tal suerte que el uso de cidos ms fuertes es innecesario. La limi tante del proceso es el contenido de protenas y cidos grasos en el alimen to ya que dan produc tos de condensaci n en estas condiciones. (S outhgate, 1991) 5.2.2.2 Por reaccin colorida con yodo La configuracin de la molcula de almid n parece ser helicoidal con un ncleo relativamen te largo. La molcula tiene dos tipos de molculas: amilosa y amilopectina, las amil osas son molculas lineales, en las cuales la glucosa esta unida por enlaces -1,4, la amil osa se dispersa rpidamen te en agua pero las cadenas se recombinan y sufren un proceso de retrogradaci n. La amil osa forma complejos con el yodo y es responsable del color azul caracterstico del complejo almidn-yodo. El complejo con yodo es del tipo de inclusin. La molcula de amilopectina ha dado evidencia de no formar complejos estables con yodo pero dan un color rojo plido en su presencia. La proporcin de amil osa y
amil opectina en el almid n tiene efectos imp ortantes en las propiedades fsicas del almidn. La determinaci n de amil osa en el almid n normalmen te envuel ve la formaci n de complejos con yodo y la titulaci n potenci omtrica de yoduro. (Southgate, 1991)
Fig. 9. Complejo de inclusi n del yodo con la amilosa 5.2.2.3 Por precipitacin de complejos con yodo El almid n se extrae de una mues tra seca con cido perclrico y se precipi ta como complejo yodurado el cual, se desc ompone antes de que se hidrolice el almidn. (Southgate, 1991). 5.2.3 Anlisis de pectinas Las soluciones pcticas son solubles en agua con una alta proporcin de galacturonanos o galac turonorhamn anos, aunque tambin arabinan os, galac tanos y arabinogalactanos han sido aislad os de la fraccin pctica de varias plantas. Las soluci ones pcticas incluyen polisac ridos que pueden ser extrados con agua caliente. Es usual aadir un agente quelan te como EDTA u oxalato de amonio al medio de extraccin para liberar aquellas pectinas que estn presen tes como sales de calcio. (Southgate, 1991)
5.2.4 Determinacin de Fibra diettica La fibra diettica se define como los polisacridos y lignina que no son digeridos por enzimas humanas (Lee y Prosky, 1995). Los mtodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se fundamen tan en aislar la fraccin del inters con la precipi tacin selectiva y despus determinar su peso. Una muestra
gelatinizada de alimento seco, desen grasado se digiere enzim ticamen te con alfaamilasa, amiloglucosidasa y proteasa para hidrolizar al almid n y la prot ena. El contenido total de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la soluci n para precipi tar toda la fibra. La solucin entonces se filtra, se recupe ra, se seca y se pesa, el residuo se reporta como fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985) Alternativamen te, los componentes solubles e insolubles en agua de la fibra pueden ser determinad os filtrando la mues tra enzim tico-digerida (Mtodo 991.43, Horwitz, 2005). La fibra soluble se encuentra en la soluci n del lquido filtrado, y la fibra insoluble en el residu o. El componente insoluble se recoge del filtro, se seca y se pesa. El componente soluble es precipi tado de la solucin agregando el alcohol del 95% al lquido filtrado, y entonces recupe rado por la filtracin, secado y pesado. Ambas metodologas se corrigen determinando protena y de ceniza de las fracciones. Estos mtodos han sido reportados oficialmen te por el AOAC y son ampliamente utilizad os en la indu stria alimen taria para determinar el contenido de la fibra de una variedad de alimen tos. Su desventaja principal es que tiende a sobres timar el contenido de la fibra de los alimentos que contienen altas concen traciones de azca res simples, por ejemplo, frutas deshi dratadas, posiblemen te porque estos carbohidratos son atrapados en los precipi tados formad os cuando se agrega el etanol 5.3 Azcares en solucin Se requie re que al tratar estas mues tras se remue van sustanci as que puedan interferir. Los pigmen tos y otras sustancias coloridas interfieren con procedimien tos colorimtricos y otros mtodos, particula rmente con los mtodos de reducci n. Para decolorar se han utilizado una gran variedad de mtodos como el uso carbn activado y tratamient os con sales de plomo. Cuando se usan sales de plomo se debe de evitar el uso de acetato de plomo bsico para medidas polarimtricas, en cuyo caso se prefiere acetato de plomo neutro, este se usa con una solucin acuosa saturada y el exceso se elimina con oxalato de plomo u oxalato de sodio. (Southgate, 1991)
5.3.1 Carbohidratos solubles totales 5.3.1.1 ndice de refraccin Cuando la radiaci n electromagntica pasa de un medio a otro, cambia de direccin, se dobla o se refracta. La relacin entre el ngulo de incidencia al seno del ngulo de refraccin se llama ndice de refraccin (RI).
El RI vara con la naturaleza del compuesto, la tempe ratura, la longitud de onda de la luz y la concen tracin del compues to. Si las tres primeras variables se hacen constantes la concen tracin del compues to se puede determinar midiendo el RI, de tal forma que el RI se utiliza para determinar slidos totales en disolucin. El uso del RI para determinar concentraciones es preciso solamen te para saca rosa pura u otras disoluciones puras, tambin se utiliza para obtener concen traci ones aproximadas de azuca res para produc tos lquid os en cuyo caso la solucin debe ser clara. Los refractmet ros pueden leer directamen te en unidades de sacarosa. (Nielsen, 1998)
5.3.2 Determinacin de carbohidratos reductores 5.3.2.1 Mtodo cido dinitrosaliclico (D S) En disolucin alcalina el azcar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un grupo nitro del DNS, para dar el produc to monoamino correspondien te. Esta reaccin da un producto c olorido en solucin alcalina. El original procedimien to de Dahlqu ist ha sido modificado en un proceso automatizado para anlisis de azucares totales producid os por la hidr lisis de polisac ridos que no contengan almid n. Para este se requiere tener estnda res simila res a la mues tra. (Southgate, 1991) La reaccin que se lleva acabo es la siguiente:
CHO H OH H OH OH COO -Na+
3 HO
H H
+
O2N NO 2
3 OH -
CH 2OH 2,3,4,5,6-penta hydroxyhexanal
COO H OH H OH OH CH 2OH O2N
COO -Na+
OH
3 HO
H H
NH 2
(Nielsen, 1998)
5.3.2.2 Mtodo de Fehling Cuando un azcar reductor se calienta en condici ones bsicas se degrada y algunos de los produc tos de degradaci n reducen los iones cpricos para formar oxido cuproso. (Pomeranz y Meloan, 2000)
Una amplia variedad de mtodos se han utilizado para determinar azuca res reductores, todos estos han sido variaciones del mtodo de Fehling. Estas variaciones han sido para cada tipo de alimen to, en cualquier caso el principal logro de modificaci ones ha sido mejorar la precisi n de reducci n y eliminar cualquier factor que interfiera con la producci n de oxido de cobre, de los factores estudiad os, la alcalinidad del reactivo, la proporcin, el tiempo de calen tamien to, la concen tracin del azca r, parecen ser los mas importantes. A partir de esto, diferentes tcnicas han sido utilizadas para determinar el oxido cuproso que se forma y se han obtenido datos de calibracin; de estos mtodos los mas usad os son el mtodo de Lane-E ynon y el mtodo Muns on y Wal ker. En el mtodo Lane- Eynon se titula con el reactivo de Fehling caliente en dos etapas, prime ro se aade una can tidad de reactivo de Fehling tal que se lleve a cabo la total reducci n y despus se determina el pun to final con azul de metileno por goteo, es necesa rio un control de la tempe ratura y se sugieren dos titulaciones. (Pomeranz y Meloan 2000)
T?cnicas de an?lisis de alimentos
PROCEDIMIENTOS
DETERMINACION DE HUMEDAD
6.1 Mtodo por secado en estufa (Nielsen, 2003) Pesar de 2 a 3 g de mues tra en un pesafil tro con tapa (previamente pesado despus de tenerlo a peso constante 2 hrs. a 130C aprox.). Secar la muestra en la estufa 2 hrs. a 100110C. Retirar de la estufa, tapa r, dejar enfriar en el desecad or y pesar tan pronto como se equilib re con la temperatura ambien te. Repetir hasta peso constante. Calcular el porcentaje de humedad, report ndolo como prdida por secado a 100-110C. 6.2 Mtodo por secado en estufa de vaco (Nielsen, 2003) Pesar de 2 a 3 g de mues tra en un pesafil tro con tapa (previamente pesado despus de tenerlo a peso constante 2 hrs. a 130C aprox.). Secar la mues tra al menos por 24 hrs. en la estufa conectada a vaco a una tempe ratura de 70C como mximo. Retirar de la estufa, tapa r, dejar enfriar en desecad or y pesar tan pronto como se equilib re con la tempe ratura ambien te. Repetir la operacin hasta peso constante. Calcular el porcentaje de humedad, report ndolo como prdida por secado en estufa de vaco a 701C. 6.3 Mtodo de secado en Termobalanza (Kirk et al, 1996) Pesar de 8 a 10 g de mues tra y colocarlos en una charola de aluminio formando una capa lo ms homognea posible. Colocar la charola con mues tra en el espacio destinado para ello en la termobalanza y encender el equip o. Registrar la prdida de peso o en su caso, el porcentaje de humedad (segn el equip o) despus de 10-15 min o bien cuando ya no haya variacin en la lectura. Calcular el porcentaje de humedad. Nota: Dependiendo del equip o, es necesa rio regular la intensid ad de la lmpa ra para evitar que la mues tra se queme y el resul tado sea errneo. 6.4 Mtodo de destilacin azeotrpica (Nielsen, 2003) Pesar 10-25 g de mues tra en un matraz bola de 500 mL con junta esme rilada. Cubrir la mues tra con tolueno (100 mL aprox.). Acople al matraz un colector para destilacin azeotrpica y un refrigerante a este ltimo en posicin de reflujo conectado al flujo de agua. Llene el vstago graduado del colector con el mismo solven te desde la parte
supe rior del refrigerante. Destile lentamen te al principio e incremen tando la velocidad hasta que toda el agua haya sido destilada. Poco antes del final de la destilaci n, lave el refrigerante con un poco de solvente desde la parte supe rior. Contine la destilacin hasta que ya no vare la can tidad de agua destilada en el tubo colector. Lea el volumen directamen te del tubo colector y calcule el porcentaje de humedad c onside rando la densidad del agua.
7
7.1
DETERMINACION DE MINERALES
Mtodo cenizas totales (calcinacin) (Kirk et al, 1996)
Colocar a peso constante un crisol 2 hrs. aproximadamen te en la mufla a 600C. Pesar de 3 a 5 g de mues tra en el crisol (la mues tra no debe sobrepasar la mitad del crisol) previamen te pesado. Calcinar la muestra, prime ramen te con un meche ro en la campana hasta que no se desp rendan hum os y posteriormen te meter a la mufla 2 hrs. cuidando que la temperatura no pase de 550C. Repetir la operacin anterior si es necesa rio, hasta conseguir unas cenizas blancas o ligeramen te grises, homogneas. Enfriar en desecad or y pesar. NOTA. No colocar los cris oles calie ntes en la mesa de la mufla. Calcular el porcentaje de cenizas.
7.2 Mtodo cenizas totales (digestin hmeda) (NOM-117-SSA1-1994)
Pesar 5 g de mues tra en un vaso de precipi tados, adici onar 10 mL de cido ntrico concen trado, calen tar durante una hora hasta la obtenci n de color traslcid o, enfriar, recupe rar, filtrar en matraz aforado de 100 mL, aforar con agua. Tomar una alcuota de 10 mL y colocarlo en un vaso de precipi tados de 250 mL a peso constante, evaporar a sequedad, colocar en estufa hasta peso constante. Calcular por diferencia de peso la cantidad de mine rales en la alcuota y relaci onarlo con el aforo total.
7.3 Determinacin de minerales
7.3.1
Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996)
Medir 10 mL de una soluci n al 1% de su mues tra en un matraz Erlenme yer de 150 mL, adici onar 15 mL de agua destilada y 1 mL de cromato de potasio al 5%, posteriormente titular con una solucin patrn de nitrato de plata 0.1N hasta que apa rezca un precipi tado seguido de un color rojo ladrillo que permanezca por lo menos 30 segundos. NOTA. En caso de que la soluci n problema presente slidos en suspensi n filtre antes de realizar la determinacin.
7.3.2
Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr (Nielsen, 2003)
Obtener por calcinac in a 500-550C las cenizas. En un matraz cnico o en crisol de porcelana blanca lavar las cenizas con un mnimo de agua. Agregar 1 mL de soluci n de cromato de potasio al 5% y titular con soluci n 0.1M de nitrato de plata hasta que aparezca un color naranja. Calcular el porcentaje de cloruros en las cenizas
7.3.3
Determinacin de Fe en las cenizas (NMX-F-503-1987)
Dilu cin de las cenizas: Al crisol fro aadir con pipe ta y en la campana 2mL de HCl concen trado para disol ver las cenizas. Evaporar en la campana, enfriar aadir 1 mL de HCl conc. y 3.5 mL de agua destilada, con un agitador de vidrio tratar de disolver las cenizas en su totalidad. Pasar cuan titativamente el lquido en un matraz aforado de 50 mL. Volver a lavar el crisol con agua por dos o tres veces ms, pasando los lquid os de lavado al matraz y despus aforar. Cuantif icaci n de hierro: Filtrar la solucin de cenizas y tomar alcuotas de 10 mL. Desa rrollar el color aadiendo en el siguien te orden: 1 mL de soluci n clorhidrato de hidroxilamina (al 10%) y agitar, 5 mL de buffer de acetatos y agitar y 1 mL ortofenan trolina al 1% y agitar. Dejar en reposo entre 10 y 15 min. Leer a 530 nm frente a un blanco prepa rado con agua tratada de la misma mane ra. Es muy imp ortante aadir los reactivos en el orden descrito. La concen tracin de hierro se obtiene interpolando en una curva patrn preparada a partir de una solucin de sulfato ferroso amoniacal tratada de la misma forma, en concentraciones de 0.01 a 0.1 mg/mL de hierro.
7.3.4
Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995)
A 50 mL de mues tra se aaden 2 mL de soluci n de hidrxido de sodio 1N o un volumen sufi ciente para obtener un pH de 12-13 y una pun ta de esptula de indicad or, y se valora con solucin de EDTA 0,01M hasta viraje de rosa a prpura.
ANLISIS DE LPIDOS
8.1 EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS
8.1.1
Mtodo de Soxhlet (James, 1999)
Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o pied ras de ebullici n en la estufa a 100C, aproximadamen te 2 hrs. Pesar de 4 a 5 g de mues tra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodn (No apretar el algodn contra la mues tra) y colocar el cartucho en el extractor. Conectar el matraz al extractor, en el que se debe encontrar el cartucho con la mues tra, y posteriormente conectar ste al refrigerante. (No poner grasa en las juntas). Agr egar dos cargas del disolvente (generalmen te ter etlico) por el refrigerante y calen tar el matraz con parrilla a ebull icin suave. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota de la descar ga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa. Una vez extrada toda la grasa, qui tar el cartucho con la muestra desen grasada, seguir calen tando hasta la casi total eliminaci n del disolvente, recupe rndolo antes de que se desca rgue. Quitar el matraz y secar el extracto en la estufa a 100C por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.2
Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000)
Colocar un vaso para aprox imadamen te 2 hrs.
Goldfish
en
la estufa
a 100C hasta
peso
constante,
Pesar de 4 a 5 g de mues tra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodn. Situar el cartucho en un recipiente con el fondo perforado y colocarlo en el sostened or del equipo. Adici onar en el vaso para Goldfish aproximadamen te 40 mL del disolvente ter etlico) y colocarlo en el equipo median te un anillo de hierro con empaque de hule. Subir la parrilla girando hacia un lado y al contrario. Calen tar hasta la extracci n comple ta de la grasa. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evap orarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa
Al finaliza r, cambiar el sostened or del cartucho por un recipien te sin perforacin y calen tar de nue vo para recupe rar el disolvente del vaso. Quitar el vaso del equipo y secar el extracto en una estufa a 100C por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.3 Mtodo por lotes
Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o pied ras de ebullici n en la estufa a 100C, aproximadamen te 2 hrs. Pesar de 5 a 10 g de mues tra en un matraz Erlenme yer de 250 mL. Adici onar 40 mL de disolvente. Agitar durante 10 min, dejar sedimen tar y filtrar la parte supe rior sobre el matraz bola. Recupe rar el residuo y adici onarle 40 mL del disolvente, agitar, dejar sedimen tar filtrar, juntar este filtrado con el anterior. y
Repetir la extraccin hasta la extraccin total de la grasa. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota del filtrado sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa. Evaporar el disolvente en rot avapor, secar el extracto lipdico en la estufa a 100C durante 30 min. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.4 Mtodo Mojonnier (James, 1999)
Pesar 10g de mues tra y colocarla en el tubo de extraccin Mojonnier Adici onar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezcla r. Adicionar 10 mL de etanol, mezclar y enfriar. Adici onar 25 mL de ter etlico, tapar el tubo y agitar vigorosamen te por un minuto. Enfriar, adici onar 25 mL de ter de petrleo, agitar vigorosamente por 30 s). Dejar reposar por 30 min o hasta que est completamen te sepa rada la fase orgnica. Si es necesa rio, adici one agua destilada para establecer una interfase entre los 2 lquid os en la parte mas angosta del tubo. Decan tar la fase etrea en un matraz bola previamen te pues to a peso constante.
Repetir la extraccin 3 veces usando una mezcla de 5 mL de etanol, 25 mL de ter etlico y 25 mL de ter de petr leo. Adici onando el extracto en el matraz bola. Evaporar el disolvente en rot avapor, secar el extracto lipdico en la estufa a 100C durante 1 h y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.5
Mtodo Rose-Gottlieb (James, 1999)
Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o pied ras de ebullici n en la estufa a 100C, aproximadamen te 1 h. A) Pretratamiento a la muestra a) Leche. Pesar 10-11g de mues tra en un tubo Rose Gottlieb. Adicionar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezcla r. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. b) Leche en polvo. Pesar 1g de mues tra en un tubo de extraccin Rose Glottlieb. Adici onar cuidad osamente 9 mL de agua y mezclar hasta que desapa rezcan los grumos. Adici onar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezcla r. Dejar reposar toda la noche a tempera tura ambiente. c) Crema. Pesar 2g de mues tra en un tubo de extraccin Rose-Gottlieb. Adicionar 8 mL de una solucin de cloruro de sodio 0.5% (m/v). Adici onar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezcla r. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. d) Yogurt, helado y dulce de leche. Pesar 4 g de mues tra en un tubo Rose-Gottlieb. Adici onar 6 mL de agua a 60C, agitar hasta dispe rsar la mue stra. Adicionar 1.5mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a tempe ratura ambiente. B) Extraccin de grasa Adici onar 10 mL de etanol, mezclar y enfriar. Adici onar 15 mL de ter etlico, tapar el tubo y agitar por un minu to. Enfriar, adic ionar 15 mL de ter de petrleo y agitar por un minu to. Dejar reposar por 30-60 min o hasta que la capa etrea est comple tamen te separada. Quitar el tapn, enjuagarlo y el cuello del matraz con 5 mL de una mezcla de ter etlico:ter de petrleo (1:1). Insertar el tubo sifn, recupe rar el solvente en el matraz bola a peso constante, enjuagar el tubo sifn con solvente recupe rando este en el matraz. Repetir la extracci n y lavados 2 veces.
Eliminar el solvente en el rot avapo r, secar el matraz por 1h a 100C y pesar. Calcular el contenido de grasa.
8.2 CARACTERIZACION DE LPIDOS

8.2.1 ndice de saponificacin (Nielsen, 2003)
Montar un equipo de reflujo en la campana, colocar en el matraz bola con boca esme rilada 2 g de lpidos y adici onar 25 mL de solucin alcohlica de KOH 0.5 M. Llevar a ebullici n suave y man tener durante 1 h. Adici onar 1 mL de solucin de fenolftalena (0.1%). Titular en caliente el exceso de lcali con cido clorhdrico 0.5 N Calcular el ndice de saponificacin (mg KOH necesa rios para saponificar los cidos grasos totales de un gramo de muestra).
8.2.2 Material Insaponificable (AOAC Official method 972.28F)
Transfe rir el lquido titulado del ndice de saponificaci n a un embudo de separacin, usando 50 mL de agua para lavar el matraz. Extraer la soluci n con 50 mL de ter etlico, tres veces, juntar los extractos etreos. Lavar dos veces con 20 mL de agua en un embudo de sepa racin los extractos etreos. Deshid ratar el extracto etreo pasnd olo por un filtro con sulfato de sodio anhidro. Recupe rar el extracto etreo en un matraz parado y evaporar el disolvente a presin reducida, hasta seque dad, u tilizando un rotavapor. Colocar el matraz en una estufa de secado a 70C, hasta llegar a peso constante. Cuantificar el material in saponificable por gramo de muestra.
8.2.3 ndice de yodo (Mtodo de Hanus) (Nielsen, 2003)
Pesar de 0.1g a 0.5g de mues tra en matraces de yodo. Adici onar 10 mL de diclorometano para disolver la grasa. Prepa rar un blanco con 10 mL de diclorometano. Pipe tear 25 mL del reactivo de Hanus en el matraz. Dejar reposar por 30 min en la oscuridad agitando ocasionalmente. Adici onar 10 mL de KI al 15%, agitar vigorosamen te. Adicionar 100mL de agua recien temen te hervida y fra, enjuagando el tapn.
Titular el yodo con una soluci n estanda rizada de tiosulfa to de sodio 0.1N adicionando gradualmen te y con agitacin vigorosa hasta que el color amarillo desaparezca. Adici onar 1mL de soluci n indicadora de almid n y continuar titulando hasta que desapa rezca el color azul. Registrar el volumen gastado. Reportar g de yodo absorbido por 100g de muestra
8.2.4 Peso especfico (Aurand et al, 1987)
Colocar un picn metro a peso constante. Llenar con el aceite y colocarlo en un bao a 25C por 30 min. Secar y pesar. Referir el peso especfico relaci onando el peso del aceite al peso del agua a 25C
8.2.5
ndice de refraccin (Aurand et al, 1987)
Se emplea un refractme tro, se realiza la prueba de 20-25C para aceites y a 40C para grasas. Se puede man tener la tempe ratura empleando un bao de agua a temperatura constante para que circule a travs de los prismas. Colocar la mues tra en los prismas del refractmet ro de campo, adecuadamente calib rado. Cierre la tapa, suavemen te, la mues tra debe cubrir comple tamen te la supe rficie del prisma. Mirar la escala a travs de la mi rilla. Leer en la escala, en la intersecci n de los campos. En caso de que la sepa racin de los camp os no sea clara, ajustar moviendo la base del objetivo. Eliminar la mues tra del prisma, utiliz ando un papel suave.
8.2.6 Vitamina A. Mtodo de Carr-Price (Aurand et al, 1987)
Preparacin de la muestra: Sap onific acin. Se agregan 30 mL de etanol a 100 mg de mues tra en un matraz de 250 mL. Posteriormente se aade 10 mL de hidrxido de potasio (50g/50mL agua) y se somete a reflujo durante 30 min. Extraccin. Una vez saponificada la muestra, se deja enfriar a temperatura ambien te. Se extrae la fraccin insaponificable en un embudo de separacin con 4 o 5 lavados de 30 mL de ter etlico. Se juntan los extractos etreos y se lavan con agua destilada hasta que los lavados no den reaccin con la fenolftalena. El extracto etreo se trata con sulfato de sodio anhid ro para eliminar el agua. Evapor aci n del solvente. El extracto etreo se evapora en el rotavapor.
Determinacin: Las lecturas de deben realizar 10 s despus de haber agregado el reactivo de Carr-Price (tricloruro de antimonio al 20% en dicl orometano o cloroformo). En un tubo se colocan 0.5mL de soluci n problema y se adici onan 5 mL del reactivo de Carr Price. Se lee en el espec tofotmet ro a 620nm Se prepa ra una curva estndar de 7-30UI/mL de la misma forma que la muestra.
8.2.7 Colesterol (Kenny, 1952)
Pesar 100 mg. de material lipdico y disolver en un volumen conocido de diclorometano. Colocar 0.2 mL en un tubo de ensaye. Adicionar con precauci n 4 mL de anhdrido actico (6.33 M en c. actico). Mezclar y dejar 10 min en reposo. Adici onar 1 mL de H2SO4 conc. y agitar con precauci n. Dejar 30 min a tempe ratura ambien te. Leer contra un blanco de reactivos a 620 nm Prepa rar una curva patrn con colesterol en un intervalo de concen tracin de 0.2 -2 mg/mL. Llevar a cabo la reaccin, como se menci ono anteriormen te y leer a 620 nm. Calcular el contenido de colesterol por gramo de lpidos y por gramo de muestra. 8.3 DETERIORO DE LPIDOS
8.3.1 Acidez titulable (Nielsen, 2003)
En un matraz Erlenm eyer de 125 o 250 mL, colocar 0.5 g de lpidos y adici onar 25 mL de alcohol previamen te neutralizado (utilizando fenolftalena 0.1% como indicador). Calen tar en un bao de agua en ebullicin suave y titular en caliente con KOH 0.0025 N, agitando fuertemen te despus de cada adicin de lcali. Calcular el ndice de acidez, como equi valen tes de KOH por 100 g de aceite.
8.3.2 Determinacin de ndice de Perxidos Method 965.33) Mtodo volumtrico (AOAC Official
Pesar 5.00 0.05 g de aceite o grasa en un matraz Erlenme yer de 250 mL y adici onar 25 mL de una soluci n de cido actico/diclorometano (3:2), disolviendo perfectamente. Adici onar 0.5 mL de una soluci n saturada de yoduro de potasio y dejar reposar en la oscuridad durante 60 s, medid os con cronmetro.
Aadir 75 mL de agua desi onizada hervida y fra, titular lentamente con tiosulfa to de sodio 0.1 N. Si se gastan menos de 3 mL, diluir el titulan te a 0.01 N. Agitar vigorosamen te durante la titulaci n hasta obtener un color ama rillo plid o. Adicionar 0.5 mL de solucin de almid n indicad or (almid n soluble al 1% en agua) y continuar la titulaci n hasta la desaparicin del color azul por 30 seg. El ndice de perxidos se obtiene calcul ando los miliequi valen tes de tiosulfa to utilizados en la titulaci n por kilogr amo de muestra.
8.3.3
Mtodo Volumtrico-Micromtodo (Crowe y White, 2001)
Pesar 0.5 0.05 g de aceite o grasa en un matraz Erlenme yer de 125 o 250 mL y adici onar 2.5 mL de una solucin de cido actico/diclorometano (3:2), disolviendo perfectamen te. Adicionar 0.05 mL de una soluci n saturada de yoduro de potasio y dejar reposar en la oscuridad durante 60 seg., medid os con cronmetro. Aadir 7.5 mL de agua desi onizada hervida y fra, adici onar 0.1 mL de solucin de almid n indicad or (almid n soluble al 1% en agua). Si se presen ta una coloracin azul oscuro (en toda la soluci n o en forma de pun tos aislad os) titular lentamen te con tiosulfa to de sodio 0.001 N hasta la desapa ricin total del color azul. El ndice de perxidos se obtiene calcul ando los miliequi valen tes de tiosulfa to utilizados en la titulaci n por kilogr amo de muestra.
8.3.4
Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo colorimtrico (Kirk et al, 1996)
Disolver una cantidad conocida diclorometano/metanol (70:30).
de
grasa
aceite
en
una
mezcla
de
Colocar el equi valen te a 0.001-0.1 g de lpidos en un tubo de vidrio y llevarlo a 10 mL con el mismo disolvente. Adici onar 0.05 mL de una solucin de tiociana to de amonio (30%), mezclar y medir la Absorbancia a 500 nm frente a un blanco de solventes (Eo). Adici onar 0.05 mL de solucin de cloruro ferroso (FeCl2), al 0.35% con 2% de HCl 10M, mezclar y tomar el tiemp o. Des pus de exactamen te 5 min medir la absorbancia a 500 nm (E2). Simul tneamen te hacer una determinaci n del blanco (E1). Prepa rar una curva de calib racin con cloruro frrico (FeCl3) en concen traciones que contengan entre 5 y 50 g de Fe/10 mL. Es imp ortante menci onar que el FeCl3 deber
encontrarse disuel to en la mezcla de disolventes. La curva se prepara mezclando 10 mL de cada diluci n de FeCl3 con 0.05 mL de tiociana to de amonio y 0.05 mL de HCl 0.2M, leyendo a la misma longitud de onda. El ndice de perxidos (IP en mEq/Kg) se obtiene relaci onando la cantidad de Fe, expresad os comog/10 mL obtenid os en la reaccin, con el peso de la mues tra. La can tidad de Fe se obtiene a par tir de la curva de calib racin, utilizando la absorbancia obtenida, una vez corregida por los blancos [E2 - (E1 + Eo)].
8.3.5
ndice de Kreis (Holm y Greenbank, 1923)
Disolver de 50 a 500 mg de grasa en 5 mL de diclorometano. Aadir 10 mL de una solucin de cido tricloroactico al 30% en cido actico glacial y 1 mL de florog lucinol al 1% en cido actico. Agitar e incubar por 15 min, en un bao mara a 45C, dejar enfriar y agregar 4 mL de etanol. Medir la absorbancia de la muestra a 540 nm frente a un blanco de reactivos. El ndice de Kreis se calcula como Abs a 540 nm/g de grasa.
ANLISIS DE PROTENAS
9.1 DETERMINACIN DE PROTENAS

9.1.1 Protena cruda. Mtodo de Kjeldahl (AOAC Official Method 2001.11)
Nota: Mtodo digestin en parrilla (boque de calen tamien to) usando cobre como catalizad or y unidad de destilaci n con vapor. Equipo Bchi
DIGESTION :
Pesar de 0.1-0.2g de mues tra e introducir en un tubo de Kjeldahl, y agregar 0.15g de sulfato de cobre pen tahidratado, 2.5g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 10 mL de cido sulfrico concentrado. NOTA. No colocar el papel. Encender el apa rato y precalen tar a la tempe ratura de 360C. Colocar los tubos en el port atubos del equipo Kjeldahl y colocarlo en el bloque de calen tamiento. (Ver Fig. 10)
Fig.10 Unidad de digestin Kjeldahl. Bchi. Ajustar la unidad de evacuaci n de gases con las juntas colocadas sobre los tubos de digestin. (Ver Fig. 11)
Fig. 11 Unidad de extraccin y neutralizacin de vapores cidos de la reaccin Kjeldahl
Accionar la trampa de succin de gases antes de que se produzcan stos. Calen tar hasta total destrucci n de la materia orgnica, es decir hasta que el lquido quede transpa rente, con una coloracin azul verdosa. Una vez finalizada la digestin, sin retirar la unidad de evacuaci n de gases, colgar el port atubos para enfriar. NOTA. Tener la precauci n de colocarlo adecuada mente, de lo contrario se podra caer. Despus del enfriamiento, terminar la digestin con la tecla stop y desc onectar la trampa.
DESTILACIN
En un matraz Erlenme yer de 250 mL adici onar (segn se indique) 50 mL de HCl 0.1N y unas gotas de indicador rojo de metilo .1% o bien 50 mL de cido brico 4% con indicadores Conectar el equipo de destilaci n y espe rar unos instantes para que se genere vapor. Colocar el tubo de digestin con la mues tra diluida y las sales disueltas en un volumen no mayor de 10 mL de agua destilada, en el apa rato de destilaci n cuid ando de introducir la alargadera hasta el fondo de la solucin. (Ver Fig. 12)
Fig. 12. Unidad de destilaci n Bchi. Presionar el botn blanco para adici onar sosa al 36% (hasta 40 mL aproximadamente). Colocar la palanca de vapor en posicin ON hasta alcanzar un volumen de destilado en el matraz Erlenme yer de 100-150mL, lavar la alargade ra con agua destilada, recoger el agua de lavado sobre el destilado. Una vez finalizada la destilaci n, regresar la palanca de vapor a la posicin original.
Titular el exceso de cido (en el caso de recibir el destilado en HCl 0.1N) con una soluci n de NaOH 0.1 N. En el caso de recibir con cido brico, con una soluci n de HCl 0.1N. Calcular el % de prot ena conside rando las reacci ones que se llevan a cabo.
9.1.2
Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)
Colocar la solucin problema debidamente diluida en una celda de cuarzo del espectrofotmetro, de 1 cm de paso, y determin ar la absorbancia a 280 nm, usando como blanco la solucin en que se encuentra preparada la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibracin prepa rada con albmina bovina srica en concentraciones de 50 a 500 g/mL
9.1.3 Mtodo de Biuret (Gornall et al, 1949)
Colocar 1 mL de la soluci n de protena adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar 4 mL del reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 min. a temperatura ambiente. Determin ar la absorbancia del color violeta producido a 540 nm contra un blanco prepa rado de la misma manera con 1 mL de la solucin en que se encuentra diluida la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibracin prepa rada con albmina bovina srica con concentraciones de 1 a 10 mg/mL.
9.1.4
Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951))
Colocar 1 mL de la solucin adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar tomando el tiempo 3 mL del reactivo C prepa rado recientemente (50 mL de A y 2 de B) Despus de exactamente 10 min adicionar a la mezcla 0.3 mL del reactivo D (1 parte de reactivo de Folin con 1 parte de agua), agitando inmediatamente. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 min. Determin ar la absorbancia del color azul producido a 750 nm contra un blanco preparado de la misma manera con 1 mL de agua en vez de la solucin problema. La concentracin de prot ena se calcula a partir de una curva patrn prepa rada con albmina bovina srica en concentraciones de 10 a 100 g/mL, tratada s de la misma manera con los reactivos.
9.1.5
Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957)
Mezclar 1 mL de la solucin problema con 4 mL de alguna de las siguientes soluciones: cido sulfosaliclico al 2.5% cido tricloroactico al 5%% ferrocianuro de potasio 0.75% y adicionar una gota de cido actico Dejar reposar durante 10 min a tempe ratura ambiente. Medir espec trofotomt ricamen te la turbidez a 600 nm, utilizando un blanco con 1 mL de agua tratada de la misma manera. La concentracin de prot enas se calcula a partir de una curva patrn prepa rada con albmina bovina srica en concentraciones de 0.1 a 1.0 mg/mL, tratada s de la misma manera con los reactivos.
9.1.6
Unin a colorantes Mtodo de Bradford (Nielsen, 2003)
Colocar en un tubo de ensaye perfectamen te etique tado, 0.1 mL de la muestra adecuadamen te dilu ida. Adici onar 5.0 mL del reactivo de colorante Azul Brillante de Coomasie G-250. Mezclar perfectamen te, en vrtex o por inversin del tubo. Dejar reposar du rante 5 min a tempe ratura ambiente. Lea la absorbancia a 595 nm, frente a un blanco de reactivos. La concen tracin de prot ena se calcula a partir de una curva patrn prepa rada con una soluci n de albmina bovina srica de 1 a 10 mg/mL, tratada de la misma mane ra que el problema.
9.2 EXTRACCION DE PROTENAS (Osborne y Mendel, 1914) La extraccin de prot enas median te el proceso secue ncial desa rrollado por Osborne y Mendel en 1914 con base en las diferenci as de solubilidad entre las prot enas. Las fracciones protenicas que se obtienen son: albminas (solubl es en agua), globulinas (solubles en soluciones salinas), prolaminas (solubl es en soluciones alcohlicas) y glutelinas (solubl es en lcali diluido)
9.2.1 A. Albminas Pesar 100 g de harina desen grasada en un vaso de precipi tados de 250 mL de agua desi onizada por 1 h en refrigeracin. Centrifugar min. Recolectar el sobrenadan te y lavar con 200 mL de agua el mismo procedimien to. Unir los sobrenad antes y dializar contra 500 mL, agitar con a 10,000 rpm por 20 residuo siguiendo el agua por 24 hrs.
cambiando por lo menos tres veces el agua, finalmen te las prot enas se liofilizan. El residuo se utiliza para la extraccin de globulinas.
9.2.2 B. Globulinas Agr egar al residuo 250 mL de soluci n salina (NaCl 0.5M) y agitar por 1 h en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min, sepa rar el sobrenadan te y lavar el residuo siguiendo el mismo procedimien to. Unir los sobrenadantes y dializar contra agua, finalmen te las protenas son liofilizada s. El residuo se utiliza para la extraccin de prolaminas.
9.2.3 C. Prolaminas Agr egar 100 mL de la solucin alcohlica (etanol al 70%-acetato de sodio 0.5%) al residuo anterior y agitar por 1 h. en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min. Colectar el sobrenadante y, lavar 2 veces ms el residuo siguiendo el mismo procedimien to. Unir los sobrenadan tes y dializar contra agua por 24 hrs. cambiando por lo menos tres veces el agua, finalmen te las prot enas se liofilizan. El residuo de utiliza para la extraccin de glutelinas.
9.2.4 D. Glutelinas Agr egar 100 mL de soluci n de etanol al 70%-acetato de sodio 0.5%-mercaptoetanol 0.1M al residuo anterior y agitar por 30 min. Sepa rar el sobrenadan te y lavar el residuo 2 veces ms con la solucin de etanol-acetato de sodio-me rcaptoetanol. Se juntan los sobrenadan tes y dializar contra agua.
9.3 PROPIEDADES FUNCIONALES
9.3.1
A. Capacidad de gelificacin
(Avanza y An, 2001)
Realizar ensa yos de calen tamien to de suspensi ones protenicas de concentracin conocida. Observar el aspecto despus de un tiempo determinado de tratamien to. Color, consistencia y textura del producto. Para realizar esta determinaci n, sellar en ambos extremos con tapones de goma tubos de vidrio de 5 cm de largo y 8 mm de dimetro. Introducir un volumen de suspensin de 0.5 mL aproximadamen te. Utilizar suspensi ones de cada fraccin protenica al 10, 7.5 y 5% p/v.
9.3.2
B. Capacidad de emulsificacin
(Fennema, 1993)
La capacidad de emulsificaci n se define como el volumen de aceite (mL) que puede ser emulsi ficado por cada gramo de protena, antes de que se produzca la inversin de fases. Para efectuar este ensayo, agitar una disolucin o dispe rsin de la prot ena en agua (o en una disoluci n salina), mien tras se va aadiend o, a ritmo constan te, aceite o grasa fundida. La inversin de fases se detecta por la cada sbita de la viscosidad, el cambio de color o el incremento de la resistencia elctrica
9.3.3
C. Capacidad de espumado (Ahmedna et al, 1999)
La capacidad de espumado se define como los mL de espuma por mL de lquido. Para determina rla, se utiliza el siguien te procedimiento: 75 mL (Vi) de soluciones al 3% (p/v) de cada una de las fracciones, mezclar por 3 min. usando una licuad ora de alta velocidad, verter en una probeta g raduada e inmedia tamen te registrar el volumen de espuma (Vf). La capacidad de espumado (FC) se calcula de acue rdo a la siguien te expresin: FC= Vf/Vi
9.3.4 D. Capacidad de retencin de agua
(Robertson et al, 2000)
La capac idad de retencin de agua se define como la cantidad e agua que permanece unida a la prot ena hidratada despus de la aplicaci n de una fuerza externa (presin, o ms comnmen te, centrifugacin). Para cuan tificar la cantidad de agua retenida por un peso conocido de prot ena se realiza el siguien te procedimiento: Pesar 1 g de mues tra y colocar en un tubo de cent rfuga, adic ionar 30 mL de agua destilada, agitar y dejar en reposo por 18 hrs. Des pus de este tiempo centrifugar a 3000rpm g por 20 min. Decan tar el sobrenadan te y pesar el residuo rehidratado, posteriormen te secar y nuevamen te pesar. La capacidad de retenci n de agua se expresa como la cantidad de agua retenida por gramo de mues tra seca.
10 ANALISIS DE CARBOHIDRATOS
10.1 CARBOHIDRATOS TOTALES
10.1.1 Mtodo del fenol-sulfrico (Dubois et al, 1956)
Prepa rar una solucin o suspen sin de la mues tra en agua, procurando que los carbohidratos se encuen tren en el intervalo de sensibi lidad del mtodo (10-100g/mL). En tubos de ensaye perfectamen te etique tados, colocar 1 mL de la soluci n o suspensin acuosa de la muestra. Para cada tubo adici onar 0.6 mL de una solucin acuosa de fenol al 5%. Mezclando perfectamen te, adici onar cuidad osamen te 3.6 mL de cido sulf rico concentrado, homogeneizar. NOTA. Realizar todo el procedi miento para un tubo antes de seguir con el siguiente. Dejar enfriar la mezcla a tempe ratura ambien te (aproximadamen te 30 min.) y determinar la intensidad del color naranja obtenido en un colormet ro a 480 nm, frente a un blanco prepa rado de la misma manera utilizando agua. Calcular la cantidad de carbohidratos presen tes en la muestra a partir de una curva patrn prepa rada con el carbohidrato de inters en el intervalo del mtodo (10-100g de glucosa/mL), tratada de la misma manera que el problema.
10.2 ANLISIS DE POLISACARIDOS

10.2.1 Determinacin de fibra diettica (985.29)
Correr un blanco a lo largo de toda la determinacin. Pesar por 1g de mues tra (exactitud de 0.1g) en matraces de 500 mL. El peso de las mues tras no debe diferir en ms de 20 mg. Adici onar 50 mL de buffer de fosfatos 0.08M pH 6 0, Medir pH y ajustar a pH 6 0.2 si es necesario. Adici onar 0.1 mL de la solucin de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el matraz en un bao a ebullici n durante 15 min. Agitar suavemen te cada 5 minu tos. Verificar con termmet ro que los matraces man tengan 95-100C durante 15 minu tos. Enfriar a tempe ratura ambiente
Ajustar a pH 7.5 0.2 adici onando 10 mL de NaOH 0.275N, agregar 5 mg de proteasa (disolver 50 mg de prot easa en 1mL de buffer de fosfatos. Adici onar 0.1mL de la soluci n a cada matraz). Cubrir el mat raz con papel aluminio y colocarlos en un bao a 60C por 30 minu tos con agitacin continua. Enfriar a tempe ratura ambien te, adici onar 10 mL de HCL 0.325N. Ajustar el pH a 4.04.6, adici onar 0.1mL de amil oglucosidasa, incubar a 60C por 30 minu tos con agitacin continua. Adici onar 280 mL de etanol 95% precalentado calen tar). Dejar en reposo 1 h a 60C (medir el volumen antes de
Pesar el crisol conteniendo la celita, hume decer y redist ribuir la cama de celita con etanol 78%. Aplicar succin. Mantener la succin y cuantitativamen te transfe rir el precipi tado de la digestin enzim tica. Lavar el residuo con 3 porciones de 20 mL de etanol 78%, lavar con 2 porciones de 10 mL de etanol 95%, lavar con 2 porciones de 10 mL de acetona, si se forma una forma una goma, mover con la esp tula para mejorar la filtracin Secar el crisol conteniendo el residuo toda la noche a 70C Enfriar en desecad or y pesar Restar el peso del crisol con la celita para conocer el peso del residuo Analizar protena a uno de los crisoles, analizar cenizas al otro crisol. Cor regir el residuo restndole las cenizas y protena correspondiente.
10.2.2 ALMIDN 10.2.2.1 Extraccin selectiva de almidn (Southgate, 1991) 10.2.2.1.1 Con cloruro de calcio (recomendado para el anlisis polaromtrico del almidn).
Colocar 2-50g de muestra en un matraz Erlenmeyer y formar una pasta con 10 mL de agua. Adici onar 50 mL de solucin de cloruro de calcio cida (620 g CaCl2 6H2O en 180 mL de agua, con 18 g de acetato de sodio trihi dratado en 20 mL de agua, ajustar el pH a 2-3 con cido actico) y calentar en autoclave a 120 C por 10 min. Enfriar la mezcla en un bao de agua fra y transf erir a un matraz aforado de 100 mL, utilizand o soluci n de cloruro de calcio hasta un volumen cercano a 90 mL. Adici onar 2 mL
de reactivo de Carrez I y mezcla r bien, adic ionar 2 mL de solucin de Carrez II, agitar nuevamente y llevar a la marca con solucin de cloruro de calcio. Filtrar a travs de papel Whatman No 541, el filtrado debe ser claro. En esta solucin se encuentra el almid n disuelto.
10.2.2.1.2 Con cido perclrico (recomendado para la formacin de un complejo insoluble con yodo).
Colocar 50-250 mg de mues tra seca en un tubo de ensaye con un poco de arena y adici onar 4 mL de agua. Calen tar en un bao de agua hirviendo el tubo por 15 min., hasta gelatinizar el almid n. Enfriar el tubo a tempe ratura ambien te y adici onar rpidamen te con agitacin 3 mL de solucin de cido perclrico al 72%. Disp ersar la muestra con una varilla de vidrio durante un minu to, repetir la operacin eventualm ente durante 15-20 min. Enjuagar con 20 mL de agua la varilla, recup erand o en el tubo, centrifugar y decantar el sobrenadante. Realizar una vez ms la extraccin en el residu o, con 4 mL de agua y 3 mL de cido perclrico. Combina r los sobrenadantes y llevarlos a un volumen de 50 mL con agua. Se recomienda analiza r inmediatamente.
10.2.2.1.3 Con etanol y cido perclrico (recomendado para realizar una reaccin con antrona o fenol-sulfrico)
Pesar aproximadamen te 0.2 g de mues tra slida finamen te molida y colocar en un tubo de centrfuga de 50 mL, adici onar dos gotas de etanol al 80% (v/v) para humedecer la mues tra. Adici onar 5 mL de agua y agitar. Adici onar 25 mL de etanol al 80% caliente, agitar y dejar reposar 5 min. Centrifugar, decantar el sobrenadan te y repetir la extracci n con 30 mL de etanol al 80%. En solucin se encuentran los azca res y para su anlisis es necesario elimina r el alcohol por evaporacin a presin reducida . Adici onar 5 mL de agua a la porcin insolubl e, posteriormente 65 mL de solucin de cido perclrico al 52% (v/v), agitar la mezcla. Continua r la agitacin por 15 min., despus adici onar 20 mL de agua, centrifugar. Decantar el sobrenadan te en un matraz aforado de 100 mL y re-extraer el residuo como se indico previamente. Mezclar los extractos y llevar a la marca con agua, filtrar la solucin si presenta partculas. Las soluci ones obtenidas pueden ser analiz adas con mtodos como el de antrona para cuantifica r los carbohidratos totales, adjudicando el valor del extracto con cido perclrico al almid n y el obtenido con etanol a los azuca res solubl es.
10.2.2.1.4 Con dimetil sulfxido (DMSO) (recomendado para preparar extractos sometidos a hidrlisis con amiloglucosidasa)
Mezclar porciones de aproximadam ente 100 mg de muestra finam ente dividid a con 20 mL de DMSO y 5 mL de HCl 8M, calentar en un bao de agua a 60C por 30 min. Diluir a 50 mL con agua y neutraliz ar con NaOH 5M. Enfriar a temperatura ambi ente y aforar a 100 mL. Filtrar si la solucin no es clara. Esta soluci n puede ser utilizad a directamente para tratami ento con amil oglucosidas a para cuantifica r la glucosa formada.
10.2.2.2 Cuan tificacin de almidn ( ielsen, 1998) 10.2.2.2.1 directa Por hidrlisis cida
Este procedimi ento puede ser usad o cuand o se sabe que slo se encu entran presentes almid n (y dextrinas ) y cuand o se permite un bajo nivel de precisin. La muestra debe estar finam ente molida o disp ersa, para que se puedan tomar alcuotas representativas. Es recomendabl e elimina r la posible presencia de azucares, por lo que se puede utiliza r el residuo insolubl e en etanol al 80%. Colocar 100-500 mg de muestra en un matraz de bola de fondo plano de 1L y agregar 450 mL de una solucin de cido sulf rico 0.18M. Colocar a ebullici n en reflujo por 4 hrs., asegurand o que todas las partcula s se encuentran inmersas en la solucin de cido, para ello a los 30 min enjuagar las paredes del matraz con la solucin, realizar agitacin leve, repetir esta operacin las veces que sean necesarias. Enfriar a temperatura ambi ente una vez concluida la hidrlisis y neutraliz ar parcialmente con una solucin de hidrxido de sodio 10M (aprox. 15 mL), llevar a un volumen de 500 mL. Filtrar y neutraliza r compl etamente con carbonato de sodio slido. Cuantifica r la glucosa liberada por la hidrlisis.
10.2.2.2.2 Por precipitacin de complejos con yodo
Se recomienda utilizar el extracto obtenido por solubilizaci n con cido perclrico. Transfe rir una porcin del extracto de c. perclrico (1 a 10 mL) a un tubo calibrado a 10, 15 y 20 mL, y diluir a 10 mL. Adici onar 2 mL de una solucin de cloruro de sodio 20% (p/v), seguida de 2 mL de soluci n de I/KI al 3%. Dejar reposar 20 min. Centrifugar y eliminar el sobrenadan te. Resuspender el precipi tado en 5 mL de solucin de cloruro de sodio alcohlica y lavar por centrifugacin.
El almid n se cuantifica gravimtricamen te o desc omponiendo el complejo en medio alcalino y cuan tifican do con un mtodo como el de ant rona o fenol-sulf rico. As mismo el almid n libe rado puede ser sometido a hidrlisis enzim tica con amil oglucosidasa y cuan tificar la glucosa liberada.
10.2.2.2.3 Por reaccin colorida con yodo
Este procedi miento nica mente puede ser utilizado cu ando el almidn se encuentra c ompletamente disu elto (gelatinizado). Colocar 2 mL de la solucin de almid n en un tubo de ensayo y adicionar 3mL de una soluci n de I/KI preparada dilu yendo 2 mL de solucin de yodo a 100 mL con agua. Medir la intensidad del color azul producido en un espec trofotmet ro a 600 nm, frente a un blanco de reactivos. Calcular la can tidad de almid n presen te en la mues tra a par tir de una curva patrn prepa rada en el intervalo de 0.02-0.2 mg de almid n soluble/mL, tratada de la misma mane ra que el problema. Los resul tados de esta determinaci n son relativos, ya que no todas las fuentes de almid n forman el mismo complejo colorido con yodo.
10.2.3 ANLISIS DE PECTINAS (Nielsen, 1998)
Colocar 3 g de mues tra desen grasada, de prefe rencia con etanol/benceno, en un embudo con filtro de vidrio poroso y extraer con una solucin al 0.5% (p/v) de oxalato de amonio durante 2 h. a 85C. Repetir la extracci n 4 veces. Combinar los filtrados y acidificar ligerame nte con HCl 1M. Adici onar 4 volmenes de etanol con agitacin y dejar sedimen tar el precipi tado. Decan tar el sobrenadan te sobre un embudo con filtro de vidrio poroso previamen te colocado a peso constante. Transfie ra el precipi tado al embudo y lave con etanol al 70% ligeramente acidificado con HCl, seguido de etanol y terminando con acetona. Colocar el embudo en la estufa a 100C hasta secar completamen te, enfriar y pesar. El residuo corresponde a las sustancias pcticas. 10.3 AZCARES EN SOLUCIN
10.3.1 Preparacin de la muestra (Southgate, 1991)
Si las soluciones de azcares tienen partcul as en suspensi n se requie re elimina rlas por filtracin en papel Whatman No. 1.
Para mues tras slidas se recomienda disolver una cantidad conocida en un volumen exacto de agua y filtrar, en caso de presen tarse material insoluble. Cuando las mues tras son turbias o muy coloridas se requie re de clarificaci n, para lo cual tomar una alcuota (entre 10 y 50 mL, dependiendo de la can tidad de azca res que contienen), y colocar en un matraz aforado de 100 mL. Diluir aproximadamen te 50 mL y tratar con 1mL de soluci n saturada de acetato de plomo, diluir al volumen y filtrar sobre papel Wha tman N 1, recupe rando una solucin clara. Para eliminar el exceso de plomo adici onar oxalato de sodio o potasio slido, mezclar y filtrar nuevamente, desca rtando los primer os mL.
10.3.2 Carbohidratos solubles totales 10.3.2.1 Medicin por ndice de refraccin (James, 1999)
Colocar una o dos gotas de la soluci n en el prisma del refractmetro de campo, adecuadamen te calibrado. Cierre la tapa, suavemen te, la mues tra debe cubrir comple tamen te la superficie del prisma. Mirar la escala a travs de la mirilla. Leer en la escala, en la intersecci n de los camp os. En caso de que la separaci n de los campos no sea clara, ajustar moviendo la base del objetivo. Eliminar la mues tra del prisma, utilizando un papel suave hmedo. Los refractmet ros ATC-1 y N10 solamen te se calib ran a 0%, colocando unas gotas de agua destilada en el prisma. Si la sepa racin de los camp os no marca 0%, en la escala, ajustar girando el tornillo que se encuen tra en la parte supe rior de la base del prisma.
10.3.3 Determinacin de carbohidratos reductores 10.3.3.1 Mtodo cido dinitrosaliclico (D S) ( ielsen, 2003)
Tomar 1mL de la soluci n acuosa de la mues tra, adici onar 1mL del reactivo de DNS y calen tar por 5 min en un bao de agua hirviente, enfriar y diluir con 10 mL de agua destilada. Leer la absorbancia del color producido a 540 nm frente a un blanco de reactivos y agua tratado igual que la muestra. Cuantificar los azcares reduc tores interpolando los valores de absorbancia obtenidos en una curva estndar prepa rada con el carbohidrato reduc tor de inters en concentraciones de 0.2 a 2 mg/mL.
10.3.3.2 Mtodo de Fehling (Aurand et al, 1987)
Mezclar en un matraz Erlenme yer 2.5 mL de soluci n A y 2.5 mL del reactivo B y agregar 50 mL de agua destilada. Calen tar a ebullici n (con un meche ro o una plancha de calen tamien to) y sin qui tar de la fuente de calen tamien to, aadir con bureta la soluci n con los carbohidratos reductores, de tal mane ra que slo falte agregar de 0.5 a 1 mL para terminar la titulaci n, para lo que debe r realiza rse una prueba inicial y agregue 0.5 mL de indicad or de azul de metileno. Todo el proceso debe realiza rse en menos de 3 min. Las soluci ones debe rn tener una concen tracin tal, que se requi era ms de 10 mL y menos de 40 mL para reducir todo el cobre del reactivo de Fehling, si se usa una bureta de 50 mL Titular el reactivo de Fehling de igual forma, empleando una soluci n estndar para obtener el factor correspondien te, que debe ser expresado como gramos del carbohidrato que reduce todo el cobre en las condici ones de trabajo.
10.4 OTRAS DETERMINACIONES
10.4.1 Determinacin de densidad calrica
La mues tra debe ser lo ms represen tativa del total, para lo cual se recomienda este finamen te molida. Si se trata de una mues tra de baja humedad (< 10 %) como harinas o similares, se puede determinar el contenido calrico directamen te. Si por el contrario se tiene una mues tra liquida o semislida, ser necesario someterla a secado de preferencia en estufa de vaco, y determinar el contenido de humedad para poder expresar el resul tado en la mues tra original. La can tidad de mue stra depende del contenido calrico espe rado, ya que se recomienda que la cantidad pesada libere aprox imadamen te 16 KJ (4.0 Kcal.), para que entre en el intervalo de detecci n del instrumento. Materiales con alta densidad calrica como grasas con 0.4 g de muestra ser suficiente; mien tras que para mues tras con baja densidad como la urea se reque rir hasta de 1.5 g de material. La mues tra en forma de harina se coloca en un crisol tarado junto con la mecha de algodn, de tal manera que el hilo quede introducido den tro de la mues tra y se procede a pesar en una balanza anal tica lo que corresp onda al peso preliminar (Pp), recomendnd ose pesar un exceso aproxima do del 10 % del peso desead o. Se compacta la mues tra con el man go metlico de tal forma que quede lo ms unif orme posible y la mecha quede introducida dentro de la mues tra, sobrando un tramo que servir para contactar con el alambre de ignicin de la bomba. Se debe eliminar con mucho cuidado el material que no se haya compac tado y el crisol con la mues tra compac tada se pesa nue vamen te para tener el peso final (Pf). El crisol se coloca en la base supe rior del pilar central de la bomba y con mucho cuidado se introduce la pun ta suelta de la mecha de algodn en el alamb re de ignicin, (ver Fig.13)
Fig. 13. Esquema de bomba calorimtrica
Se procede a realizar la combus tin, para lo cual se debe revisar que el O-RING se encuen tre en perfectas condici ones, ya que se debe obtener un cierre hermtico. El cierre se realiza colocando el capu chn de la bomba sobre el anillo metlico y se gire ste hasta que coincida la rosca con el del capuc hn, el sellado se debe hacer con la fuerza de la mano, no utilizar h erramien ta alguna. En seguida se coloca el sensor del termopar en el orificio del capuchn. Teniendo sumin istro de Oxgeno a presin (cil indro con mnimo 30 bars), se procede abrir la vlvula de paso girando de a la perilla y se debe obtener una presin den tro de la bomba balstica de 25 bars (1 bar 0.987 atm) en aproximadamente 20 a 30 seg. Una vez alcanzada la presin, se cierra la vlvula de paso y se procede a ajustar el galvanmetro prime ro con la ayuda del ajuste grueso y posteriormen te con el disp ositivo de ajuste fino. Si las condici ones anteriores se man tienen por aprox imadamen te 10 s, se oprime el botn de ignicin y en 10 a 15 s se lleva a cabo la combus tin, n otndose por un aumen to en la presin del man metro, que a su vez se traduce en una seal en la escala del galvanmetro, ya que una vez alcanzado el valor mximo empieza a decaer rpidamen te. La lectura mxima obtenida en el galvanmet ro, es directamen te proporcional al calor liberado en la combustin. Una vez tomada la lectura, se abre la vlvula de salida de los gases de combus tin, la cual se localiza en la base de la bomba del lado opues to a entrada del oxgeno; a la vez, se desconecta el sensor del termopar y una vez liberados los gases de combus tin, se procede abrir la bomba girando el anillo metlico en sentido inverso al cierre. Por ltimo cierre la vlvula de liberaci n de gases y enfre el capuch n de la bomba en un bao de agua fra hasta tempe ratura ambien te, para poder realizar una nue va determinacin. CLCULOS. Para poder calcular la densidad calrica de la mues tra, es necesa rio contar con una curva estnda r, para la cual se debe realizar la combus tin de dife rentes pesos de cido Benzoico y anotar la respec tiva lectura del galvanmetro. Se recomienda pesar entre 0.1 a 0.7g de cido benzoico (valor calrico certificad o); adems ser necesario llevar acabo la combus tin exclusi va de la mecha de algodn, ya que el valor obtenido se debe restar, o la escala del galvanmetro se puede ajustar para obtener la lectura en forma directa. Es necesa rio realizar la determinaci n mnimo por triplicad o, y una vez obtenida la lectura, se debe convertir a unidades energticas, para lo cual tenemos las siguientes conversiones: 1 g de cido benzoico = 26, 454.3 J = 26.45 KJ
4.1868 KJ = 1 Kcal Una vez que se cuente con la curva estndar de contenido calrico (abscisas) en funci n de la lectura del galvanmetro (ordenadas), se podr obtener por interpolacin la densidad calrica de la mues tra. La determinaci n calrica en la bomba calorimtrica, da la mxima energa potencial que en trminos fisic oqumicos corresponde al calor de combus tin del respec tivo material. Por si mismo el termino de Energa Gruesa (EG) no tiene un valor prctico desde el pun to de vista alimen ticio, ya que los trmin os de mayor aplic acin son aquell os que nos dan la energa biodisponible, como es el caso de la energa metab olizable (EM). No obstante varios inves tigadores han realizado estudi os bastante comple tos y represen tativos en alimen tacin hum ana y animal, de los cuales se han podido derivar ecuaci ones relativamen te sencillas, que nos pueden estimar con cierta exactitud, trminos energticos de aplicaci n prctica. A continuaci n, se tienen algunas frmulas que pueden estimar con cierta aproximaci n, trminos energticos biolgicos a partir de la EG, digestibilidad aparente y composicin qumica de los Alimen tos o dieta. TND = (g prot ena / g dieta) + (g CHOs / g dieta) + [2.25 * (g lpidos / g dieta)] ED = TND x 18.42 EM = 0.95 EG 31.88 N EM = [(0.95 F) EG] 31.4 N Donde: TND: total de nutrientes digeribles EM: energa metabolizable (KJ/g) EG: energa gruesa (KJ/g) ED: energa di gerible (KJ/g) N: nitrg eno (g N/ g de alimento) F: fibra cruda (g fibra/ g de alimento) La penl tima frmula se usa para dietas que tengan un contenido bajo de fibra cruda (< de una ingesta de 30 g de fibra/ da); mien tras que la ultima puede ser usada para cualquier tipo de dieta, pero se debe contar con el dato de contenido de fibra.
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ANEXO 12 PREPARACION DE SOLUCIONES

12.1 Reactivo de Hanus
Disolver 13.615 g de yodo en 825 mL de cido actico glacial, calen tar para disolver. Enfriar. Tomar 25 mL de la soluci n de yodo y titular con tiosulfa to 0.1N, usando 1mL de almid n como indicador. Adici onar 3mL de Bromo a 205 mL de cido actico glacial. A 5 mL de solucin de bromo adici onar 10 mL de KI al 15% y titular con tiosulfa to de sodio al 0.1N y 1 mL de almid n como indicador. Calcular el volumen de la solucin de bromo reque rida para adic ionar a los 800 mL de soluci n de yodo, de forma que la soluci n final contenga el doble de halgeno.
12.2 Reactivo de DNS
Mezclar 80 mL de NaOH al 10% con 150 mL de agua destilada, agregar 150 g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado Calen tar a 50C y agitar constantemente Agr egar 5 g de DNS y agitar constantemen te a 50C., enfriar a temperatura ambien te y filtrar. Aforar a 500 mL. Gua rdarlo en frasco mbar en lugar fresco y seco.
12.3 Reactivo de Biuret
1.- Dis olucin A: Disolver 1,5 g de CuSO4.5H2O y 6 g de tartrato sdico-potsico en 500 ml de agua destilada. 2.- Dis olucin B: Prepa rar 300 ml de NaOH al 10% (p/v) 3.- Juntar las disoluciones A y B y llevar el volumen a 1 litro
12.4 Reactivo de Lowry
Preparacin de las soluciones Solucin prestock: Disolver 4 g de NaOH + 30 g de Na2CO3. Aforar con agua destilada a 1 L (guardar a tempe ratura ambiente). Tartrato de Sodio y Potasio 4% (wv): Disolver 4g de KNaC4H4O6. 4H2O y aforar con agua destilada a 100 mL (guardar en refrigerador). Sulfato cprico 2% (wv): Disolver 2g de sulfato de cobre y afora con agua destilada a 100mL (guardar a tempe ratura ambiente). Solucin Lowry A: Mezclar 1 ml de solucin de tartrato de sodio y potasio + 1 ml de solucin sulfato de cobre aforar con solucin pre-stock a 100 ml. Nota: respe ta el orden de adicin de las soluci ones para evitar formaci n de precipi tados. La cantidad de nues tra a prepa rar es de acue rdo al nme ro de mues tras a procesar. Solucin Lowry B: Diluir Reactivo Folin 1:1 con agua destilada. Calcular la can tidad a prepa rar segn las mues tras procesadas diarias. Esta soluci n se dura solo un da.
12.5 Reactivo de Fehling (James, 1999)
Reactivo A Disolver 69.28 g de sulfato de cobre pen tahi dratado y 1 mL de cido sulf rico 1M en 1L de agua. La soluci n puede almacena rse indefinidamente Reactivo B Disolver 346g de tartrato de sodio y potasio tetrahid ratado (sal de Rochelle) y 100g de hidrxido de sodio en agua y aforar a 1L. La solucin es estable indefinidamen te si es almacenada en un recipiente hermtico
12.6 Reactivo de yodo (para determinacin calorimtrica de almidn)
Pesar 1.269 g I2 y mezcla rlos con 1.8 g de KI disolver en 100 mL con agua.
12.7 Ortofenantrolina al 1%
Pesar 0.1g de ortofenan trolina y disolverlo en 80mL de agua destilada a 80C, enfriar y aforar a 100 mL)
12.8 Buffer de Acetatos para determinacin de Fe
Pesar 8.3 g de acetato de sodio anhid ro, adicionar 12 mL de cido actico glacial y aforar a 100 mL con agua destilada
12.9 Acido brico con indicadores
Pesar 40g de cido brico y disolverlo en 800 mL de agua destilada posteriormente adici onar 35 mL de fenolftalena al 0.1% en alcohol, y 10 mL de una mezcla de rojo de metilo 0.066% con verde de bromocresol 0.033% en alcohol. Aforar a 1L
12.10 Reactivo colorante Azul Brillante
Prepa rar una soluci n colorante de Azul Brillante de Coomasie G-250 0.1 mg/mL con cido fosfrico al 8.5% y etanol al 4.75%.
12.11 Solucin de Carrez I Pesar 21.9 g de acetato de zinc dihidratado y adicionar 3.0 mL de c. Actico glacial, aforar a 100 mL de agua 12.12 Solucin de Carrez II
Pesar 10.6 g de ferrocianuro de potasio y disolverlo en 100 mL de agua 12.13 Solucin I/KI al 3% Disolver 7.5 g de I2 y 7.5 g de KI en 250 mL de agua
12.14 Solucin alcohlica de cloruro de sodio
Mezclar 350 mL de alcohol con 50 mL de soluci n de NaCl 20% y aforar a 500 mL con agua

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ANLISI S DE ALIMENTOS.

An?lisis de Alimentos. Fundame ntos y t?cnicas

An?lisis de Alimentos. Fundame ntos y t?cnicas

ndice de Kreis. ......................................................................................................19 ndice de TBA .........................................................................................................19

An?lisis de Alimentos. Fundame ntos y t?cnicas

An?lisis de Alimentos. Fundame ntos y t?cnicas

Fig. 1. Diagrama de destilaci n azeotrpica

Secad o en estu fa de vaco

Destil acin aze otrpica

Fig. 3. Esquema de extraccin Soxhlet.

Fig. 4. Equ ipo de extraccin Goldfish

Fig. 5. Matraz de extraccin Mojonnier

3.2 CARACTERIZACIN DE LPIDOS

4 4.1 Determinacin de protenas 4.1.1 Mtodo de Kjeldahl

Fig. 6. Estructura qumica de los amin ocidos aromticos

Fig. 7. Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos

Interfere ncia de amoniaco, buffer, detergentes Baja sensibilidad

CH 2OH 2,3,4,5,6-penta hydroxyhexanal

COO H OH H OH OH CH 2OH O2N

T?cnicas de an?lisis de alimentos

T?cnicas de an?lisis de alimentos

T?cnicas de an?lisis de alimentos

Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996)

T?cnicas de an?lisis de alimentos

Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr (Nielsen, 2003)

Determinacin de Fe en las cenizas (NMX-F-503-1987)

Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995)

T?cnicas de an?lisis de alimentos

8.1 EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS

Mtodo de Soxhlet (James, 1999)

Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000)

Colocar un vaso para aprox imadamen te 2 hrs.

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Mtodo Rose-Gottlieb (James, 1999)

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8.2 CARACTERIZACION DE LPIDOS

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ndice de refraccin (Aurand et al, 1987)

T?cnicas de an?lisis de alimentos

T?cnicas de an?lisis de alimentos

Mtodo Volumtrico-Micromtodo (Crowe y White, 2001)

Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo colorimtrico (Kirk et al, 1996)

Disolver una cantidad conocida diclorometano/metanol (70:30).

T?cnicas de an?lisis de alimentos

ndice de Kreis (Holm y Greenbank, 1923)

T?cnicas de an?lisis de alimentos

9.1 DETERMINACIN DE PROTENAS

Fig. 11 Unidad de extraccin y neutralizacin de vapores cidos de la reaccin Kjeldahl

T?cnicas de an?lisis de alimentos

T?cnicas de an?lisis de alimentos

Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)

Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951))

T?cnicas de an?lisis de alimentos

Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957)

Unin a colorantes Mtodo de Bradford (Nielsen, 2003)

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9.3 PROPIEDADES FUNCIONALES

(Avanza y An, 2001)

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C. Capacidad de espumado (Ahmedna et al, 1999)

9.3.4 D. Capacidad de retencin de agua

(Robertson et al, 2000)