INFORME DE LABORATORIO CONCENTRACION CELULAR

PRESENTADO POR

FRANCY MANTILLA 1310576 LEIDY SANGUINO ALEYDA RUIZ 1310577 1310578

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER LICENCIATURA EN BIOLOGIA Y QUIMICA 25 DE JULIO DE 2012 CUCUTA

INFORME DE LABORATORIO CONCENTRACION CELULAR

PRESENTADO POR FRANCY MANTILLA LEIDY SANGUINO ALEYDA RUIZ 1310576 1310577 1310578

PRESENTADO A AZULA SANGUINO

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER LICENCIATURA EN BIOLOGIA Y QUIMICA 25 DE JULIO DE 2012 CUCUTA

METODOLOGIA

Activamos la levadura, agregando 10 gramos de la misma en 90 ml de una solucin de sacarosa al 10%. Tomamos 1 ml de la solucin de sacarosa y levadura y la adicionamos en un tubo de ensayo con 9 ml de agua peptona y se denomina 10-1 De la dilucin 10-1, tomamos 1 ml y lo adicionamos en un tubo de ensayo con 9 ml de agua peptona y se denomina 10 -2, esto lo seguimos realizando hasta llegar a la dilucin 10-4. Tomamos una muestra con un tubo capilar de la dilucin 10-4, y la difundimos en un lado de la cmara de Neu Bauver. Tomamos una muestra con un tubo capilar de la dilucin 10-3, y la difundimos en el otro lado de la cmara de Neu Bauver. Observamos en el microscopio en el objetivo de 40X, contamos en los 5 cuadrantes, el nmero de clulas. Realizamos la sumatoria de las clulas contadas en los 5 cuadrantes.

ANALISIS DE RSULTADOS

DILUCION 10-4 CUADRANTE 1 2 3 4 5 SUMATORIA N DE CELULAS 2 2 0 1 3 8 Clulas

Como el total de clulas obtenidas en la dilucin 10-4 fue muy bajo, se realizo el conteo con la dilucin 10-3. DILUCION 10-4 CUADRANTE 1 2 3 4 5 SUMATORIA CONCENTRACIN N DE CELULAS 13 7 5 5 8 38 Clulas

IMPORTANCIA DE LAS LEVADURAS Las levaduras se han definido como hongos microscpicos, unicelulares, la mayora se multiplican por gemacin y algunas por escisin. Este grupo de microorganismos comprende alrededor de 60 gneros y unas 500 especies. Histricamente, los estudios sobre microbiologa enolgica se han centrado en las levaduras pertenecientes al gnero Saccharomyces, que son las responsables de la fermentacin alcohlica. Anteriormente se crea que slo ellas participaban en el proceso de produccin de alcohol, sin embargo, las diferentes levaduras noSaccharomyces, especialmente durante la fase inicial de la fermentacin, pueden influir en las propiedades organolpticas de las bebidas alcohlicas. El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido sino hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teoras cientficas de esa poca reconocan la presencia de stas en la fermentacin alcohlica, pero eran consideradas como compuestos qumicos complejos, sin vida. Esta era la teora mecanstica liderada por los qumicos alemanes von Liebig y Whler. Luis Pasteur, propuso la teora vitalstica y demostr que las clulas viables de levaduras causan fermentacin en condiciones anaerobias; durante la cual el azcar presente en el jugo es convertido principalmente en etanol y CO2. (Mora, A)

Las levaduras son los agentes de la fermentacin y se encuentran naturalmente en la superficie de las plantas, el suelo es su principal hbitat encontrndose en invierno en la capa superficial de la tierra. En verano, por medio de los insectos, polvo y animales, son transportados hasta el fruto, por lo que su distribucin se produce al azar. Existe un gran nmero de especies que se diferencian por su aspecto, sus propiedades, sus formas de reproduccin y por la forma en la que transforman el azcar. Las levaduras del vino pertenecen a varios gneros, cada uno dividido en especies. Las especies ms extendidas son Saccharomyces ellipsoideus, Kloeckera apiculata y Hanseniaspora uvarum, las cuales representan por s solas el 90% de las levaduras utilizadas para la fermentacin del vino. Como todos los seres vivos, tienen necesidades precisas en lo que se refiere a nutricin y al medio en que viven. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan una alimentacin apropiada rica en azcares, elementos minerales y sustancias nitrogenadas, tienen ciclos reproductivos cortos, lo que hace que el inicio de la fermentacin sea tan rpido, pero as como se multiplican, pueden morir por la falta o el exceso de las variables mencionadas. (Mora, A)

CAMARA DE NEUBAUER A pesar del enorme desarrollo tecnolgico que ha tenido lugar en los laboratorios cientficos, el conteo visual con hematocitmetro sigue siendo el mtodo de conteo ms extendido desde el siglo XIX. El presente artculo se escribe con la intencin de ayudar a realizar un conteo celular con un hematocitmetro o cmara de Neubauer a principiantes, y tambin a tcnicos o investigadores experimentados que deseen recordar las bases del mismo. (Bastidas, O) LA CMARA DE NEUBAUER, O HEMATOCITOMETRO. Se trata de una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm y unos 4 mm de grosor. En una cmara simple, la porcin central, que es donde se realiza el conteo, est dividida en 3 partes.

Figura 1. Cmara de Neubauer comercial

Figura 2. Pila de cubreobjetos, y caja.

En la parte central se encuentra grabada una retcula cuadrangular. En el caso de cmara doble, que son las ms comunes, existen 2 zonas de conteo, una superior y otra inferior al eje longitudinal de la Cmara. La retcula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1mm de lado cada uno. En caso de recuento de sangre, los cuadrados de las esquinas son los destinados al recuento de leucocitos. Al existir estos en menor nmero que los hemates, se necesitan menos lneas de referencia para realizar el conteo. El cuadrado central es el destinado al recuento de hemates y plaquetas. Se divide en 25 cuadrados medianos de 0,2 mm de lado, y cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados pequeos. El cuadrado central est por tanto formado por 400 cuadrados pequeos. (Bastidas, O) CUBREOBJETOS. El cubreobjetos es un cuadrado de cristal de aproximadamente 22 mm x 22 mm. Debe colocarse sobre la cmara de recuento de forma que cubra la parte central de la cmara, delimitando un espacio entre la cmara y el cubreobjetos de 0,1 mm. Es comn que el cubreobjetos quede ligeramente levantado cuando aplicamos ms lquido del necesario a la cmara. Para evitar esto, existen algunas cmaras que tienen dos pinzas especiales para evitar que el cubreobjetos se levante, y la distancia sea mayor de 0,1 mm. (Bastidas, O)

Figura 3. Detalle de la rejilla de una cmara de Neubauer Improved

CONTEO CELULAR, PASO A PASO PASO 1. Preparacin de la muestra. Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha habr de preparar una muestra con una concentracin apta para su recuento. Tpicamente, el rango de concentraciones que permite contar el hematocitmetro est entre 250.000 clulas y 2,5 millones de clulas por ml. Intentaremos que la muestra tenga una concentracin en torno a (1 milln) aplicando las diluciones correspondientes. Por debajo de 250.000 clulas / ml (2,5 * ) la cantidad de clulas contadas no es suficiente para poder dar una estimacin lo suficientemente fiable de la concentracin celular 1. La concentracin ptima para conteo en hematocitmetro es de 1 milln de clulas por ml = clulas /ml. Por encima de 2,5 millones (2,5 * ) la probabilidad de cometer errores de conteo crece demasiado, y tambin el tiempo y esfuerzo necesario para realizar un recuento con fiabilidad. Por encima de esta concentracin es conveniente diluir la muestra para acercar la concentracin al rango ptimo. (Bastidas, O) PASO 2. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer Se toman 10 uL de la mezcla preparada en el paso 1 con la micropipeta. 1. Se coloca un cubreobjetos sobre la cmara de Neubauer, y se coloca en posicin horizontal sobre la mesa, en un lugar donde nos sea cmodo pipetear. 2. se introduce una punta desechable en el extremo de la micropipeta, 3. se ajusta la micropipeta para succionar 10 uL de lquido. Generalmente este ajuste se realiza girando el botn del embolo para seleccionar el volumen deseado. 4. se introduce la punta de la micropipeta en la muestra 5. Se pulsa el pistn o embolo superior de la pipeta suavemente hasta que se siente como el pistn llega al final de su recorrido. 6. Se saca la punta de la pipeta de la muestra, y siempre mantenindola en posicin vertical se lleva hasta la cmara de Neubauer. 7. Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cmara de Neubauer. Se trata de dejar que el lquido penetre entre la cmara y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad 8. Se suelta el pistn suavemente mientras se supervisa que el lquido est entrando correctamente y de forma uniforme en la cmara. 9. En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya salido bien, repetir la operacin.

Ya tenemos la cmara de Neubauer cargada, lista para el recuento celular. (Bastidas ,O)

Figura 4. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer PASO 3. Preparacin y enfoque del microscopio. 1. Colocar la cmara de Neubauer en la bandeja del microscopio. Si el microscopio dispone de pinza de sujecin, fijar la cmara con ella. 2. Encender la luz del microscopio. 3. Enfocar el microscopio hasta que pueden verse ntidas las clulas mirando por el binocular. 4. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En este ejemplo vamos a contar 5 cuadros grandes de una cmara de Neubauer Improved de 0,1mm de profundidad. 5. Realizar el recuento de clulas en el primer cuadro. Existe una convencin por la cual si las clulas tocan el lmite superior o el lmite izquierdo del cuadro, deben contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el lmite inferior o el lmite derecho. (Bastidas, O)

Figura 5. Conteo de un cuadro grande de cmara de Neubauer.

Figura 6. Recuento con alta concentracin celular.

Figura 7. Recuento de 5 cuadros grandes de cmara de Neubauer Improved.

PASO 4. Clculo de la concentracin. Aplicamos la frmula del clculo de concentracin celular.

El nmero de clulas es la suma de todas las clulas contadas en todos los cuadros. El volumen es el volumen total de todos los cuadros donde hemos hecho el recuento. Como el volumen de 1 cuadro grande es: 0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie 0,01 * 0,1 mm (profundidad) = 0,01 * 0,01 cm = 0,0001 = 0,0001 ml La frmula para recuento con cuadros grandes en cmara de Neubauer

En el caso de que hayamos aplicado una dilucin, deberemos trasformar la concentracin obtenida durante el recuento celular en la concentracin de la muestra original. En este caso tendremos que dividir el resultado por la dilucin aplicada. La frmula quedar:

Ejemplo: Para una dilucin de 1: 10. Dilucin = 0,1 Para una dilucin de 1: 100, Dilucin = 0,01 Error Errores de hasta 20% y 30% son comunes con este mtodo de recuento debido al pipeteo, a los errores estadsticos por ser la muestra poco representativa, errores del volumen de muestra realmente introducido en la cmara, etc. Sin embargo, el hematocitmetro sigue siendo uno de los mtodos ms ampliamente utilizados en los laboratorios de todo el mundo. (Bastidas, O)

CONCLUSIONES Las levaduras son de gran importancia en el campo industrial. Las levaduras permiten la fabricacin de panes, vino, cervezas, entre otras. La principal levadura utilizada es la saccharomyces cerevisiae. La cmara de Neu Bauver consiste en un portaobjetos de cuarzo con una graduacin en la superficie y una medida muy concreta. La cmara de Neu Bauver, nos facilita el conteo de clulas, lo que nos permite hallar la concentracin celular.

BIBLIOGRAFIA Mora, A. Importancia de la levadura. [documento en lnea]. consultado en: http://alezamora.galeon.com/aficiones1893538.html Bastidas, O. Cmara de Neu Bauver. [documento en lnea]. consultado en: http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo-CamaraNeubauer.pdf