PIPETAS

AUTOMTICAS

Las pipetas son dispositivos que se caracterizan por carecer de depsito y que se utilizan para medir o transvasar pequeos volmenes de lquido de un recipiente a otro con gran exactitud. Inicialmente se fabricaron en vidrio pero hoy en da existen una gran variedad de opciones. Podramos hacer una primera divisin en pipetas de volumen fijo y pipetas de volumen variable. Las de volumen fijo son ms precisas que las de volumen variable, aunque cuando en un anlisis se usa una de volumen variable habiendo ajustado el volumen requerido y sin variarlo ms, su precisin es comparable a la de una pipeta de vidrio graduada de clase A. Tambin podramos dividirlas en pipetas manuales y electrnicas, aunque estas ltimas son mucho menos abundantes debido fundamentalmente a su precio mucho ms elevado, por lo que nos centraremos en las manuales. A su vez tambin podramos distinguir entre pipetas monocanal y multicanal.

La pipeta mecnica o de pistn funciona generalmente transmitiendo la fuerza que un operador, de forma manual, ejerce sobre un mbolo que se encuentra unido a un pistn mediante un eje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija, forzando un volumen predefinido de lquido fuera de la pipeta. Las pipetas a pistn son en general de dos tipos como hemos visto antes: las de volumen fijo, que dispensan un volumen predeterminado de lquido, el cual es conocido como volumen nominal (Vn) y las de volumen variable que permiten ajustar el volumen dispensado dentro de un rango determinado en las especificaciones de la pipeta. La variacin en el volumen se logra modificando la longitud de la carrera del pistn dentro del mbolo mediante un micrmetro. En estas de volumen variable el volumen nominal es el lmite superior del rango de volumen de la pipeta, de acuerdo con las especificaciones dadas por el fabricante. Cada uno de los tipos mencionados se pueden subdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas del subtipo A se denominan pipetas de desplazamiento por aire o neumticas, debido a que existe un volumen de aire entre la cabeza del pistn y el lquido en el cilindro (este es el tipo ms corriente). A las pipetas del subtipo B se les denomina pipetas de desplazamiento positivo o de desplazamiento directo porque el pistn se encuentra en contacto directo con el lquido.

Las pipetas de desplazamiento directo se recomiendan para lquidos con alta densidad, alta viscosidad o alta presin de vapor. Presentan el inconveniente de que las puntas a utilizar son mucho ms caras puesto que cada punta lleva su pistn incorporado (a la manera de una jeringuilla). Es por esta caracterstica que tambin evitan contaminaciones cruzadas provenientes de la pipeta o de aerosoles y muestras. Las pipetas neumticas usan puntas mucho ms baratas pero no son tan exactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabaja con volmenes muy pequeos de lquido debido a la compresibilidad del aire.

Todas las pipetas de pistn disponen de puntas desechables para minimizar los riesgos de contaminacin. Para facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han adoptado un cdigo de color segn el volumen a dispensar y que en las de uso ms general coincide con el color de las puntas utilizadas.

Instrucciones para el manejo de una pipeta automtica

Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado. Colocar una punta de plstico (adecuada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presin para lograr un buen ajuste.

1. Oprimir el botn pulsador con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir verticalmente la pipeta, hasta que la punta se sumerja de 2 a 5 mm dentro del lquido. 2. Liberar lentamente la presin sobre el botn. Despus de 23 segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del lquido deslizando la punta contra la pared del recipiente.

3. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el lquido, presionar lentamente el botn pulsador hasta el primer tope. Despus de un segundo, y sin soltar el botn pulsador, terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el segundo tope.

4. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente.

RECOMENDACIONES GENERALES AL PIPETEAR El empleo de una buena tcnica al utilizar las pipetas puede incrementar la exactitud hasta en un 5 %. Hay tanto aspectos instrumentales y de condiciones ambientales como de tcnica de manejo de la pipeta. EN LA TCNICA EMPLEADA + PROFUNDIDAD DE INMERSIN DE LA PUNTA La profundidad de inmersin de la punta es especialmente importante en el uso de volmenes pequeos. Si la punta se sumerge demasiado, se aspirar ms lquido debido al aumento de la presin. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y

volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad adecuada puede mejorar la precisin hasta un 5%.

+ UNIFORMIDAD AL PIPETEAR Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y tcnica adecuada al mover el mbolo. Una aspiracin demasiado rpida e incontrolada puede llevar a la formacin de aerosoles, salpicaduras y posible contaminacin del eje y del pistn, pudindose producir incluso prdida de volumen de la muestra. Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisin tambin hasta un 5%.

+ ANGULO DE INMERSION VERTICAL Se ha de procurar mantener el ngulo de inmersin de la pipeta lo ms cercano a la vertical posible. De otra forma, la columna vertical de lquido ser ms pequea y se aspirar demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el lquido, la punta se ha de mantener en un ligero ngulo frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de forma vertical o como mximo dentro de un ngulo menor de 20 de sta, puede mejorar la precisin hasta en un 2,5%.

+ TCNICA DE DISPENSACIN Para la mayora de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente. As se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en el interior de la punta despus de acabar la dispensacin. Retirad la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier gotcula restante en el orificio de la punta. Esta tcnica puede mejorar la precisin hasta en un 1%. Otra tcnica consiste en dosificar directamente en la superficie del lquido. Es crucial usar una punta de pared fina para que no quede ninguna gotcula en el interior de la punta. Si se dispensa directamente dentro del lquido tendremos que sacar la

pipeta mantenindola en el segundo tope para evitar una toma de muestra despus de la dispensacin.

+ ENJUAGE PREVIO DE PUNTAS Se recomienda enjuagar previamente las puntas como mnimo dos veces con el lquido a pipetear para compensar la pelcula de lquido en el interior de la punta. El enjuage previo tambin tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.

Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la precisin.(No es necesaria en pipetas a pistn de desplazamiento positivo).

OTROS FACTORES QUE TAMBIN AFECTAN A LOS RESULTADOS DEL PIPETEO

+ TRABAJAR SIN CAMBIOS BRUSCOS DE TEMPERATURA Procurad pipetear a una temperatura constante. La temperatura ptima sera: que como veremos despus sera tambin adecuada para calibrarlas. Debemos evitar repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del interior de la pipeta no se puede adaptar rpidamente y esto puede afectar al volumen. Pipetear a una temperatura constante puede mejorar la precisin hasta en un 5%. Es por este motivo que cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede calentar el aire del interior de la pipeta, expandindose y pudiendo reducir la precisin hasta en un 1%. Es por esta razn que se recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y entre ciclos, dejarla en su soporte o en la mesa.

+UTILIZACIN DE UNA PIPETA ADECUADA PARA EL VOLUMEN QUE SE ASPIRA La aspiracin al 50% del volumen nominal de las puntas consigue mejores resultados. Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen mximo de la pipeta. Seguir este consejo

puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%. Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10% del volumen nominal de la pipeta que estamos utilizando.

+ AJUSTE CORRECTO DEL MICROMETRO PARA EVITAR LOS EFECTOS DEBIDOS A LA HOLGURA MECANICA Cuando cambiemos el volumen de uno superior a otro inferior simplemente hay que girar la rueda del micrmetro hacia abajo hasta el volumen deseado. Por el contrario, cuando incrementamos el volumen a pipetear, hay que subir la rueda ligeramente por encima del volumen deseado para luego bajarla hasta el deseado. Esto evitar el juego mecnico de las piezas y contribuir a una mejora del 0,5% en la precisin. + FACTORES ERGONMICOS Para todos aquellos que pipeteen de forma repetitiva la mayor parte de la jornada se recomienda usar pipetas especialmente suaves de accionamiento porque es fundamental que las manos estn lo ms descansadas posibles. Normalmente cada fabricante importante tiene en su gama algn modelo de este tipo.

PARTE PRCTICA.
Nos centraremos en los dos tipos ms comunes de pipetas que podemos encontrar en los laboratorios, que son pipetas tipo Gilson o tipo Eppendorf. Cada tipo tiene sus particularidades, pero el procedimiento de calibracin es el mismo para ambas.

Partes especificadas: A.- Botn de control B.- Tuerca de conexin C.- Junta de tefln D.- Anillo de goma (O-ring) E.- Caa F.- Expulsor de la punta

Como diferencia fundamental las de tipo Gilson tienen el pistn de acero inoxidable, una junta de tefln (C) y un anillo de goma (D) que son los que garantizan el sello hermtico. En las de tipo Eppendorf, el mbolo es de un polmero orgnico (Fortron) altamente resistente al calor, cidos y bases, envejecimiento y abrasin, y no lleva ni junta de tefln ni anillo de goma. Es una ligera capa de silicona de vaco alrededor del mbolo la que asegura la estanqueidad en este caso. Para el caso en que pipeteemos cidos es mejor usar una de tipo Eppendorf puesto que slo se nos deteriora con el tiempo la capa de grasa. En una de tipo Gilson, acaba corroyndose el mbolo a pesar de acero (ver foto) con lo que tendremos que sustituirlo para que la pipeta no gotee. Para evitar en lo posible

este efecto de los cidos, Gilson ha sacado un kit de proteccin anticorrosin para la P 1000 que consiste en una caa especial que lleva acoplado un filtro anticidos, siendo ste intercambiable (al igual que el filtro de proteccin anti-salpicaduras de las P 5000). Si no disponemos de este kit especial la casa recomienda una vez despus de haber usado la pipeta con lquidos cidos o corrosivos que emitan vapores, desmontar la caa y lavar el pistn, el anillo de goma y la junta de tefln con agua destilada y una vez completamente secas montar y comprobar funcionamiento.

Por calibracin de pipetas se entiende la comparacin entre el volumen real y el volumen terico. El volumen real se determina por va gravimtrica por lo que necesitaremos agua destilada o desionizada y una balanza adecuada.

Para realizar la calibracin de una pipeta seguiremos las directrices dadas por la norma ISO 8655 (aparatos volumtricos operados por pistn). Los premisas pricipales de dicha norma se centran en 3 puntos fundamentales:

1.- Condiciones ambientales 2.- Utilizar una balanza adecuada 3.-Minimizar el efecto de la evaporacin en volmenes inferiores a 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.

- CONDICIONES AMBIENTALES Las calibraciones se deben realizar en una sala sin corrientes de aire y con una temperatura comprendida entre 20C y 25C sin variar ms de 0,5 C mientras dure el ensayo. Asimismo se necesita una humedad relativa mayor del 50%. Con anterioridad a la calibracin se deber dejar al menos 2 horas todo el material a emplear para que alcance un equilibrio trmico con la temperatura de la sala. Nunca deber estar expuesto al sol directamente. Necesitaremos disponer de un termmetro y tambin un barmetro si calibramos pipetas de menos de 50 l y debemos realizar ajustes por el efecto de la evaporacin.

- UTILIZAR UNA BALANZA ADECUADA Para el caso de calibraciones de pipetas de 10 l o inferiores habr de emplearse una balanza analtica de 5 decimales. Para pipetas de volmenes ms grandes es suficiente utilizar una balanza de 4 decimales. Se aconseja el uso de vasos de vidrio para minimizar los efectos de las cargas electrostticas, ms importantes cuanto ms pequeos son los volmenes que estamos midiendo.

- MINIMIZAR EL EFECTO DE LA EVAPORACIN Para volmenes pequeos (menores de 50 l ) podemos usar algn recipiente especfico de vidrio con tapa o situar un vaso de precipitados pequeo con 10 ml de agua en el interior de la balanza para inhibir la evaporacin. Es ms cmodo emplear el recipiente especial porque nos simplificar los clculos despus. Existen marcas que comercializan su propio juego de recipientes para efectuar las calibraciones de sus distintos modelos.

PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIN
Abriremos la pipeta para comprobar el estado de la junta de tefln y el anillo de goma (Gilson). Si stos presentan juego, los sustituiremos. Tambin verificaremos que la caa no est doblada y en buenas condiciones. En caso contrario, tambin la cambiaremos. Para el caso de las Eppendorf, retiraremos la grasa vieja del pistn y procederemos a reengrasarlo ligeramente de nuevo (es importante no poner demasiada). Tras el enjuage previo de la punta al menos dos veces con agua destilada, haremos un chequeo rpido con 3 medidas del volumen nominal que nos darn una primera aproximacin del volumen que dispensa la pipeta. Si ste se desva bastante del esperado, procederemos al ajuste del micrmetro con la herramienta adecuada para cada pipeta (en el caso de Eppendorf se nos suministra al comprarla pero en Gilson tenemos que adquirirla) y volveremos a hacer otra tanda de 3 medidas hasta que stas ya sean ms cercanas a lo esperado. Posteriormente y despus del cambio de punta y enjuages previos de sta al menos dos veces, realizaremos ya la calibracin propiamente dicha con tandas de 10 medidas (4 mediciones sera el nmero mnimo necesario para calcular la exactitud y precisin de una pipeta) de las siguientes series de volmenes: + volumen nominal (mximo admitido por la pipeta) + volumen inferior (mnimo o 10% del nominal segn especificaciones del fabricante) + volumen medio (del 50% del valor nominal)

Para cada serie de valores obtenidos pasaremos a calcular el error sistemtico que nos dar la Exactitud

(proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio, que nos expresar la Precisin (grado de reproducibilidad de las medidas) de la pipeta. Exactitud Es posible tener datos muy consistentes aunque estn consistentemente equivocados. La inexactitud es la diferencia numrica entre el valor medio de una serie de medidas y el valor real. Una elevada exactitud (o pequea inexactitud) significara que existiera poqusima diferencia entre el valor medio y el real. La exactitud se consigue con una cuidadosa calibracin de un instrumento preciso. Precisin La precisin consistira en la existencia de un buen grado de reproducibilidad de las medidas realizadas. La precisin no tiene un valor numrico, se cuantifica por la imprecisin. As una alta precisin (o pequea imprecisin) significara que existiese muy poca variacin entre medidas repetidas de la misma muestra. Para conseguir un instrumento preciso se necesita una buena tcnica de manejo.

Exacto Preciso

Preciso Inexacto

Exacto Impreciso

Impreciso Inexacto

- Clculo del Error Sistemtico ( Exactitud )

Para el caso en que trabajemos con volmenes inferiores a 50 l deberemos tener en cuenta los efectos de la evaporacin sustituyendo en las anteriores frmulas Xi por: Xi . Z , donde Z es un factor de correccin dependiente de la temperatura y la presin y cuyos valores podemos obtener de la tabla de la siguiente pgina ( Equivalencia: 1000 mbar = 100 kPa ). Para poder comparar adecuadamente con los datos facilitados por el fabricante debemos expresar los valores obtenidos en la balanza en microlitros.

- Clculo del Error Aleatorio ( Precisin )

Comparando los datos obtenidos con los errores tolerados para las pipetas ensayadas podemos saber si nuestras pipetas se encuentran dentro de las tolerancias especificadas por el fabricante en cuanto a Exactitud y Precisin y por tanto siguen siendo perfectamente utilizables . Lo ms conveniente es llevar una anotacin de las calibraciones efectuadas y ponerle algn adhesivo pequeo a la pipeta que nos indique la fecha de su ltima revisin o calibracin.

Podemos ajustar una pipeta para un lquido diferente al agua pero en este caso deja de ser una pipeta de volumen variable y pasa a ser una de volumen fijo empleado en la calibracin y solamente vlida para ese lquido, por lo que si se realiza, hay que marcar la pipeta convenientemente para que luego no existan confusiones. Este procedimiento no es vlido para lquidos con presin de vapor elevada por lo que en estos casos, como se ha indicado previamente, es aconsejable el empleo de una pipeta de desplazamiento positivo o directo. De todas formas, cuando esto no sea posible y para minimizar todo lo posible el error cometido si usamos una pipeta neumtica, se recomienda saturar la cmara de aire de la pipeta aspirando y dispensando repetidamente el solvente antes de aspirar la muestra y luego operando rpidamente porque aunque nuestra pipeta habitualmente no gotee con soluciones acuosas s que es muy fcil que lo haga si trabajamos con un lquido de menor densidad que sta. Actualmente lo ms avanzado en el tema de las calibraciones es el sistema de identificacin por radiofrecuencia que ha sacado Rainin en que la pipeta lleva un chip con el que se puede seguir toda la vida de cada pipeta como n de serie, fecha de calibracin, usuario al que pertenece, para qu se utiliza o cualquier dato que queramos incluir.

Existen varios fabricantes de balanzas que ofrecen en sus gamas de balanzas analticas alguna especialmente adaptada para la calibracin de micropipetas como es el caso de la mostrada a continuacin que sirve para pipetas de hasta 1 l (tara: 22g, resolucin 1 g), tiene apertura motorizada mediante clula fotoelctrica y presenta colector de evaporacin integrado y recipiente para residuos de 10 ml de capacidad para pipetear de forma rpida y sin interrupciones.