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    Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)
    Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)
    Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)
    Ebook84 pages38 minutes

    Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)

    By Roberta Bongiorno

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    About this ebook

    Negli ultimi 10 anni si sono registrati progressi molto significativi nello sviluppo di piccole molecole per il trattamento della fibrosi cistica (CF), molecole che sono correttori o potenziatori del canale CFTR. Tuttavia, queste molecole incrementano rispettivamente la quantità del canale nella membrana plasmatica e la probabilità di apertura del canale. Correttori e potenziatori per agire richiedono quindi la presenza della proteina

    Tuttavia, circa il 10% della popolazione affetta da CF mostra mutazioni non-senso che causano la formazione di un codone di terminazione prematura (PTC) associato a una proteina CFTR incompleta e non funzionale. In questo contesto genetico i correttori e i potentatori non possono agire.

    Una potenziale terapia per mutazioni non-senso è quella di migliorareil readthrough del PTC mediante l'uso di piccole molecole, denominate Translational Readthrough Inducing Drugs (TRIDs). Al fine di testare questi farmaci, abbiamo prodotto un modello CF utilizzando cellule tiroidee di ratto (FRT) che non esprimono il gene CFTR endogeno.

    In queste cellule, abbiamo trasfettato un vettore plasmidico contenente la mutazione CFTR-W1282X (UGA-opale) che è stato usato per testare tre nuove molecole di TRIDs.
    LanguageItaliano
    PublisherYoucanprint
    Release dateJul 22, 2020
    ISBN9788831686174
    Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)

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      Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs) - Roberta Bongiorno

      INDICE

      INTRODUZIONE

      LA FIBROSI CISTICA

      IL GENE CFTR E LE SUE MUTAZIONI

      STRUTTURA DELLA PROTEINA CFTR

      APPROCCI ATTUALI DIRETTI AL DIFETTO DI BASE PER LA CURA DELLA FIBROSI CISTICA

      TERAPIA GENICA

      TERAPIA FARMACOLOGICA

      Modulatori

      Potenziatori e Correttori

      MOLECOLE AD AZIONE READTHROUGH E MECCANISMO DEL READTHROUGH

      AMMINOGLICOSIDI

      ATALUREN E TRIDS

      EFFICIENZA DI READTHROUGH

      IL PATHWAY DI DECADIMENTO DEGLI MRNA CONTENENTI CODONI DI STOP PREMATURI: PATHWAY NMD

      SCOPO DELLA RICERCA

      MATERIALI E METODI

      COLTURE CELLULARI

      TRASFEZIONE DELLE CELLULE FRT EYFP+/+ CFTR-/-

      ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE

      RETROTRASCRIZIONE

      REAL TIME RT PCR

      ANALISI DI IMMUNOFLUORESCENZA

      WESTERN BLOT

      SAGGIO DI QUENCING DELLA FLUORESCENZA DELLA PROTEINA EYFP

      RIDUZIONE DELL’ATTIVITÀ DEL PATHWAY NMD

      RISULTATI

      INGEGNERIZZAZIONE DELLE CELLULE FRT EYFP+/+ CON IL VETTORE PLASMIDICO PTRACER-CFTRW1282X-OPAL

      CARATTERIZZAZIONE DELLE CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL

      VALUTAZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA CFTR IN CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL DOPO TRATTAMENTO CON MOLECOLE AD AZIONE READTHROUGH

      VALUTAZIONE DELLA FUNZIONALITÀ DELLA PROTEINA CFTR IN CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X DOPO TRATTAMENTO CON MOLECOLE AD AZIONE READTHROUGH

      Saggio del quencing della fluorescenza della proteina EYFP

      L’INIBIZIONE DEL PATHWAY NMD INCREMENTA LA QUANTITÀ DEL TRASCRITTO DEL GENE CFTR FAVORENDO UN MAGGIORE EFFETTO READTHROUGH DELLE MOLECOLE NV

      ANALISI DI WESTERN BLOT IN CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL IN SEGUITO ALL’INIBIZIONE DEL PATHWAY NMD

      SAGGIO DI QUENCING DELLA FLUORESCENZA DELLE PROTEINA EYFP SU CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL IN SEGUITO ALL’INIBIZIONE DEL PATHWAY NMD

      DISCUSSIONE

      BIBLIOGRAFIA

      SITOGRAFIA

      RINGRAZIAMENTI

      Abstract

      In the last 10 years there has been highly significant progress in the development of small molecules for treating cystic fibrosis (CF), molecules that are correctors or potentiators of the CFTR channel. However, these molecules act as enhancer respectively, of the quantity of the channel in the plasmatic membrane, and of the probability of channel opening. Correctors and potentiators to act require the presence of the protein (whit several type of alterations as folding, gating, etc.).

      However, about the 10% of the population affected by CF shows nonsense mutations that cause the formation of premature termination codon (PTC) associated to an incomplete and unfunctional CFTR protein. In this genetic contest the correctors and the potentiators can’t act.

      A potential therapy for nonsense mutations is to improve translational readthrough of PTC by the use of small molecules, named Translational Readthrough Inducing Drugs (TRIDs). In order to test these drugs, we produced a CF model using rat thyroid cells (FRT) that don’t express the endogenous CFTR gene.

      In these cells, we transfected a plasmid vector harboring the CFTR-W1282X (UGA-opal) mutation and we used them to test three new TRIDs molecules.

      Nevertheless, these analyses showed a weak level of CFTR-opal transcript, because of the activation of NMD pathway. In order to increase the amount of this mRNA, the efficiency of NMD pathway was reduced by the use of siRNA targeting Upf1 and caffeine.

      Introduzione

      La Fibrosi Cistica

      Con circa 70.000 persone affette e 1000 nuovi casi l’anno, la Fibrosi Cistica (FC) è la malattia genetica letale più diffusa al mondo, con una mortalità che si attesta a circa il 90% dei casi [Misbahuddin M, 2017]. Un individuo su

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