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Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)
Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)
Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)
E-book84 pagine38 minuti

Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)

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Info su questo ebook

Negli ultimi 10 anni si sono registrati progressi molto significativi nello sviluppo di piccole molecole per il trattamento della fibrosi cistica (CF), molecole che sono correttori o potenziatori del canale CFTR. Tuttavia, queste molecole incrementano rispettivamente la quantità del canale nella membrana plasmatica e la probabilità di apertura del canale. Correttori e potenziatori per agire richiedono quindi la presenza della proteina

Tuttavia, circa il 10% della popolazione affetta da CF mostra mutazioni non-senso che causano la formazione di un codone di terminazione prematura (PTC) associato a una proteina CFTR incompleta e non funzionale. In questo contesto genetico i correttori e i potentatori non possono agire.

Una potenziale terapia per mutazioni non-senso è quella di migliorareil readthrough del PTC mediante l'uso di piccole molecole, denominate Translational Readthrough Inducing Drugs (TRIDs). Al fine di testare questi farmaci, abbiamo prodotto un modello CF utilizzando cellule tiroidee di ratto (FRT) che non esprimono il gene CFTR endogeno.

In queste cellule, abbiamo trasfettato un vettore plasmidico contenente la mutazione CFTR-W1282X (UGA-opale) che è stato usato per testare tre nuove molecole di TRIDs.
LinguaItaliano
Data di uscita22 lug 2020
ISBN9788831686174
Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs)
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    Anteprima del libro

    Produzione di cellule FRT CFTR-W1282X per lo studio avanzato di molecole ad azione readthrough (TRIDs) - Roberta Bongiorno

    INDICE

    INTRODUZIONE

    LA FIBROSI CISTICA

    IL GENE CFTR E LE SUE MUTAZIONI

    STRUTTURA DELLA PROTEINA CFTR

    APPROCCI ATTUALI DIRETTI AL DIFETTO DI BASE PER LA CURA DELLA FIBROSI CISTICA

    TERAPIA GENICA

    TERAPIA FARMACOLOGICA

    Modulatori

    Potenziatori e Correttori

    MOLECOLE AD AZIONE READTHROUGH E MECCANISMO DEL READTHROUGH

    AMMINOGLICOSIDI

    ATALUREN E TRIDS

    EFFICIENZA DI READTHROUGH

    IL PATHWAY DI DECADIMENTO DEGLI MRNA CONTENENTI CODONI DI STOP PREMATURI: PATHWAY NMD

    SCOPO DELLA RICERCA

    MATERIALI E METODI

    COLTURE CELLULARI

    TRASFEZIONE DELLE CELLULE FRT EYFP+/+ CFTR-/-

    ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE

    RETROTRASCRIZIONE

    REAL TIME RT PCR

    ANALISI DI IMMUNOFLUORESCENZA

    WESTERN BLOT

    SAGGIO DI QUENCING DELLA FLUORESCENZA DELLA PROTEINA EYFP

    RIDUZIONE DELL’ATTIVITÀ DEL PATHWAY NMD

    RISULTATI

    INGEGNERIZZAZIONE DELLE CELLULE FRT EYFP+/+ CON IL VETTORE PLASMIDICO PTRACER-CFTRW1282X-OPAL

    CARATTERIZZAZIONE DELLE CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL

    VALUTAZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA CFTR IN CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL DOPO TRATTAMENTO CON MOLECOLE AD AZIONE READTHROUGH

    VALUTAZIONE DELLA FUNZIONALITÀ DELLA PROTEINA CFTR IN CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X DOPO TRATTAMENTO CON MOLECOLE AD AZIONE READTHROUGH

    Saggio del quencing della fluorescenza della proteina EYFP

    L’INIBIZIONE DEL PATHWAY NMD INCREMENTA LA QUANTITÀ DEL TRASCRITTO DEL GENE CFTR FAVORENDO UN MAGGIORE EFFETTO READTHROUGH DELLE MOLECOLE NV

    ANALISI DI WESTERN BLOT IN CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL IN SEGUITO ALL’INIBIZIONE DEL PATHWAY NMD

    SAGGIO DI QUENCING DELLA FLUORESCENZA DELLE PROTEINA EYFP SU CELLULE FRT EYFP+/+ PTRACER-CFTRW1282X-OPAL IN SEGUITO ALL’INIBIZIONE DEL PATHWAY NMD

    DISCUSSIONE

    BIBLIOGRAFIA

    SITOGRAFIA

    RINGRAZIAMENTI

    Abstract

    In the last 10 years there has been highly significant progress in the development of small molecules for treating cystic fibrosis (CF), molecules that are correctors or potentiators of the CFTR channel. However, these molecules act as enhancer respectively, of the quantity of the channel in the plasmatic membrane, and of the probability of channel opening. Correctors and potentiators to act require the presence of the protein (whit several type of alterations as folding, gating, etc.).

    However, about the 10% of the population affected by CF shows nonsense mutations that cause the formation of premature termination codon (PTC) associated to an incomplete and unfunctional CFTR protein. In this genetic contest the correctors and the potentiators can’t act.

    A potential therapy for nonsense mutations is to improve translational readthrough of PTC by the use of small molecules, named Translational Readthrough Inducing Drugs (TRIDs). In order to test these drugs, we produced a CF model using rat thyroid cells (FRT) that don’t express the endogenous CFTR gene.

    In these cells, we transfected a plasmid vector harboring the CFTR-W1282X (UGA-opal) mutation and we used them to test three new TRIDs molecules.

    Nevertheless, these analyses showed a weak level of CFTR-opal transcript, because of the activation of NMD pathway. In order to increase the amount of this mRNA, the efficiency of NMD pathway was reduced by the use of siRNA targeting Upf1 and caffeine.

    Introduzione

    La Fibrosi Cistica

    Con circa 70.000 persone affette e 1000 nuovi casi l’anno, la Fibrosi Cistica (FC) è la malattia genetica letale più diffusa al mondo, con una mortalità che si attesta a circa il 90% dei casi [Misbahuddin M, 2017]. Un individuo su

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