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Morfologia Microscopica e Ultrastrutturale: Istologia e Anatomia Microscopica

Morfologia Microscopica e Ultrastrutturale: Istologia e Anatomia Microscopica

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Morfologia Microscopica e Ultrastrutturale: Istologia e Anatomia Microscopica

valutazioni:
3/5 (1 valutazione)
Lunghezza:
763 pagine
4 ore
Pubblicato:
14 ago 2015
ISBN:
9788874888832
Formato:
Libro

Descrizione

Morfologia Microscopica e ultrastrutturale si sviluppa secondo un percorso affermatosi nella facoltà Medica milanese, dove gli insegnamenti di istologia e anatomia Microscopica risultano integrati nei contenuti e nei tempi. il testo comprende una prima parte di citologia, introdotta dai capitoli sui metodi di studio e sulla organizzazione della sostanza vivente, a cui fanno seguito gli argomenti propriamente morfologici, sviluppati in forma di sintesi essenziale. Nella seconda parte, dedicata all’istologia, viene affrontato lo studio dei tessuti con particolare attenzione all’approccio microscopico e ultrastrutturale. la terza parte, dove viene affrontata l’anatomia Microscopica, rappresenta l’applicazione delle parti precedenti per l’apprendimento di una metodologia a fini diagnostici in ambito morfologico. allo scopo di facilitare la comprensione dei vari argomenti trattati, la parte teorica risulta arricchita da una iconografia particolarmente accurata, sia con immagini di microscopia ottica ed elettronica sia con disegni e schemi dettagliati.
Pubblicato:
14 ago 2015
ISBN:
9788874888832
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Libro

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Anteprima del libro

Morfologia Microscopica e Ultrastrutturale - Maria A. Goffredi

22.5.Telencefalo

PARTE I

CITOLOGIA

In questo capitolo vengono forniti i principi generali delle metodiche di comune impiego nelle ricerche di tipo cito-istologico, al fine di poter analizzare poi con correttezza le caratteristiche morfologiche e strutturali di cellule e tessuti. L’esposizione risulterà piuttosto sintetica e sarà integrata da tabelle schematiche al fine di indicare in linee generali i criteri alla base delle varie tecniche di uso corrente.

1.1

Metodi di studio

L’approccio allo studio di un campione biologico è sempre parziale: per questo motivo la scelta di una metodica è fondamentale ai fini dello studio che si intende intraprendere. Data la complessità dei viventi è necessario applicare metodiche adeguate ai diversi livelli di organizzazione: i principi generali delle metodiche di comune impiego nello studio di tipo citologico e istologico si possono riassumere in due gruppi principali (tabella 1.1).

I metodi per l’osservazione diretta di cellule e tessuti viventi rappresentano la condizione ottimale per il loro studio, ma hanno diverse limitazioni rappresentate principalmente da: a) difficoltà di tenere in vita frammenti di tessuto o cellule isolate dall’organismo di cui fanno parte; b) spessore del materiale da esaminare che impedisce il passaggio del fascio luminoso del microscopio; c) scarso contrasto delle strutture che costituiscono cellule e tessuti per cui il materiale biologico risulta scarsamente apprezzabile.

L’osservazione in vivo può essere condotta su organismi unicellulari o su parti di metazoi di modesto spessore e quindi trasparenti quali le membrane sierose che rivestono le grandi cavità corporee (es. peritoneo) oppure cellule isolate mediante l’utilizzo di sottili aghi da tessuti piuttosto spessi (es. fibre muscolari).

Colture in vitro - Particolarmente importante per lo studio in vivo dell’attività cellulare è il metodo di "coltura in vitro": con questa terminologia si intendono le colture di organo, le colture tissutali e le colture cellulari. Gruppi di cellule o frammenti di tessuto ad alta attività proliferativa (tessuti embrionali o neoplastici) vengono espiantati dall’organismo e, dopo dissezione meccanica, sono sottoposti a digestione enzimatica con tripsina (fig. 1.1). Questa scinde i legami proteici tra le cellule e tra cellule e matrice: bloccata la lisi con un inibitore, la sospensione cellulare viene centrifugata. Le cellule vengono quindi seminate in capsule o piastre di Petri contenenti un mezzo di coltura adeguato (terreno liquido) arricchito con siero e antibiotici: in questo ambiente le cellule si moltiplicano e aderiscono al substrato fino a confluire. Le cellule che resistono a questi passaggi adattandosi alle condizioni di coltura costituiscono una coltura primaria.

Figura 1.1. A) Schema delle principali tappe per l’allestimento di colture in vitro; B) Monostrato di cellule in coltura al MO: fibroblasti di topo (da preparato).

Le cellule vengono quindi staccate dal piano della piastra con tripsina, risospese in terreno liquido e riseminate in giusta densità: si ottiene così una linea cellulare. Dal tessuto di origine, durante questi passaggi, si assisterà ad una selezione in base al grado di proliferazione: la popolazione cellulare risulterà in prevalenza costituita da elementi ad elevata capacità riproduttiva, da cellule stabili in grado di sopravvivere ma non di duplicarsi mentre altri tipi cellulari non saranno in grado di adattarsi alle condizioni in coltura.

La stabilizzazione di una linea cellulare rende quindi disponibile una popolazione cellulare abbastanza omogenea, anche se frutto di modificazioni genetiche conseguenti ad una selezione rispetto al tessuto originale.

Le colture di cellule e di tessuti sono un accettabile sistema sperimentale anche per i tessuti umani in quanto ci consentono di isolare le unità viventi e di esporle all’azione di diversi agenti. Il rapido progresso di procedimenti tecnici ha portato a migliorare notevolmente questi modelli sperimentali permettendo di approfondire meccanismi morfogenetici, processi biosintetici, interazioni tra cellule, attività e modalità d’azione di farmaci di nuova sintesi ecc. È opportuno ricordare, soprattutto per gli indiscussi vantaggi clinici a cui hanno portato, che le colture cellulari sono state ampiamente impiegate per lo studio e la valutazione dell’effetto antiproliferativo e citotossico di agenti antitumorali su linee cellulari stabilizzate di derivazione umana. I principali limiti di queste metodiche sono dati dal fatto che rappresentano dei sistemi biologici artificiali e, pertanto, avulsi dall’insieme organismo per cui non possono essere trasferiti "in vivo" senza opportune valutazioni e correzioni.

Colorazioni vitali e sopravitali - La colorazione vitale consente di evidenziare cellule con potere granulopessico, capaci cioè di captare e immagazzinare, in forma di granuli, sostanze estranee non utilizzabili per il loro ricambio, come i coloranti vitali.

I coloranti vitali sono composti di natura colloidale, a particelle in gran parte dotate di carica elettrica negativa, con tossicità relativamente bassa che possono venire iniettati in dosi successive nell’animale da esperimento in vivo (colorazione vitale o intra vitam) così da stimolare il potere granulopessico di un numero sempre maggiore di cellule. Alcuni tipi cellulari assumono in vivo questi coloranti particolari e li trattengono in forma di granuli: all’interno del citoplasma si osservano pertanto granuli di colorante che rendono riconoscibili le stesse cellule vive o particolari componenti citoplasmatiche. Sacrificando quindi l’animale si possono riconoscere, in sedi appropriate, le cellule che hanno captato e immagazzinato il colorante rispetto a quelle circostanti che non possiedono questa capacità (fig. 1.2). Con questa tecnica è stato quindi possibile fare valutazioni sulla quantità e sulla distribuzione di determinati tipi cellulari dotate di questa capacità. In alternativa si può immergere un frammento di organo o di tessuto, appena prelevato da un animale da esperimento, nel liquido colorante e ottenere, dopo rapido lavaggio del pezzo, che alcune cellule rimangano colorate (colorazione sopravitale).

Le sostanze coloranti più largamente impiegate per le colorazioni vitali e sopravitali si dividono in tre gruppi: a) coloranti neutri come il rosso neutro impiegato soprattutto per gli embrioni; b) coloranti basici come il blu tripan e il blu pirrolo; c) coloranti specifici come il verde Janus per i mitocondri. La colorazione sopravitale può essere applicata anche a cellule e tessuti in vitro, aggiungendo il colorante al terreno di coltura.

L’osservazione di tessuti in vivo o a fresco è difficoltosa per il comportamento della materia vivente che, essendo quasi del tutto trasparente alla luce visibile, non può essere eseguita con il microscopio ottico composto ma richiede l’utilizzo di particolari strumenti ottici quali microscopio a contrasto di fase o microscopio a fluorescenza.

L’analisi morfologica quindi si basa per necessità sull’esame di cellule e tessuti fissati e colorati secondo diverse modalità.

Figura 1.2. Colorazione vitale con blu pirrolo. Le cellule colorate vitalmente in blu sono indicate dalla punta di freccia in giallo. Si tratta di elementi distribuiti lungo capillari (freccia), tipici del fegato e sono dei macrofagi (cellule di Kupffer). La colorazione rossa dei nuclei degli epatociti (freccia bianca) e di parte del citoplasma è stata effettuata in un secondo tempo sulle sezioni (da preparato).

1.2

Tessuti fissati e colorati: preparati stabili

L’osservazione di materiale biologico per indagini citologiche e istologiche si basa sull’impiego di strumenti ottici che, come prima regola, richiedono la trasparenza del materiale. Ciò presuppone che il materiale da esaminare sia sufficientemente sottile da poter essere attraversato dai raggi luminosi e che le strutture che lo compongono siano ben contrastate. Molto raramente i tessuti presentano queste caratteristiche necessarie per l’osservazione diretta per cui, quasi sempre, il materiale deve essere opportunamente preparato.

L’allestimento di preparati istologici stabili, destinati all’osservazione al microscopio ottico composto e ad una successiva archiviazione, richiede una tecnica ben standardizzata i cui passaggi fondamentali sono rappresentati nella fig. 1.3.

II materiale biologico opportunamente fissato e incluso, viene tagliato al microtomo e le sezioni vengono raccolte su vetrini portaoggetto (tabella 1.2 – fig. 1.4). Tali vetrini vengono sparaffinati in adeguati solventi e dopo necessaria idratazione vanno incontro a colorazione con coloranti che, nella maggior parte dei casi, sono attivi in soluzione acquosa.

Figura 1.3. Schema delle principali tappe di allestimento di preparati istologici per il microscopio ottico.

Figura 1.4. Inclusione, taglio e colorazione per la microscopia ottica.

Nella fig. 1.5 viene rappresentato il principio che sta alla base del meccanismo d’azione dei coloranti impiegati in Istologia: l’Ematossilina è il rappresentante della famiglia dei coloranti basici più utilizzato ed è quello più comunemente usato nei metodi di colorazione più semplici; l’Eosina appartiene ai coloranti acidi e viene anch’esso ampiamente impiegato nella metodiche comuni.

Figura 1.5. Meccanismo d’azione di Ematossilina (basico) e di Eosina (acido).

A questo punto i metodi di colorazione morfologici più comuni meritano un breve cenno.

Ematossilina - Eosina È un metodo di colorazione abbastanza semplice e rapido come esecuzione e impiega i due coloranti che abbiamo citato come esempio per il meccanismo d’azione che sta alla base delle colorazioni istologiche: il risultato è rappresentato (fig. 1.6) dai nuclei colorati in viola e il citoplasma delle cellule e il materiale extracellulare in rosa aranciato. Questa colorazione viene sempre eseguita per fare le prime osservazioni generali e per valutare la bontà del materiale (fissazione, taglio ecc.).

Azan Il metodo Azan permette di ottenere dei preparati d’insieme più completi e differenziati rispetto al metodo precedente: si basa sul principio che l’uso di due o più coloranti usati contemporaneamente in miscele ben bilanciate portano ad una colorazione differenziale simultanea. Esso impiega un colorante basico (azocarminio) e una soluzione colorante di natura acida costituita da almeno due coloranti acidi (blu di anilina e orange G): questa miscela differenzia maggiormente le parti acidofile di cellule e tessuti. Il risultato (fig. 1.7) è rappresentato dai nuclei colorati in rosso, dal citoplasma in aranciato, le fibre muscolari in rosso mentre la sostanza intercellulare (che permette di differenziare il tessuto connettivo) risulta colorata in azzurro più o meno intenso. Questo metodo è piuttosto complesso in quanto richiede anche fasi intermedie di mordenzatura cioè di preparazione del tessuto al fine di fissare su di esso gruppi atti a legare successivi coloranti.

Ematossilina ferrica La tecnica di colorazione con ematossilina ferrica viene solitamente impiegata per lo studio di dettagli citologici difficili da evidenziare con altre colorazioni. Il metodo richiede una ematossilina preparata in modo particolare (di Heidenhain) dopo avere pretrattato i vetrini con reagenti a base di Fe. Alla colorazione vera e propria segue una differenziazione (tecnica regressiva) che permette di mettere in evidenza i confini cellulari, alcune specializzazioni di superficie, la striatura trasversale delle fibre muscolari (fig. 1.8), alcuni organuli e i cromosomi.

Blu di toluidina Il metodo che impiega il blu di toluidina (fig. 1.9) si può applicare sia su materiale incluso in paraffina (dopo sparaffinatura) sia su materiale incluso in resina. Quest’ultimo si impiega quando è necessario disporre di sezioni più sottili rispetto alla norma: per esempio per valutare la bontà del materiale che verrà poi indagato al TEM si usa preparare sezioni semifini di circa 1μm di spessore, vengono raccolte sul vetrino portaoggetto e colorate con blu di toluidina, senza necessità di eliminare la resina. Il blu di toluidina colora intensamente in blu-viola i nuclei, le aree citoplasmatiche ricche in ergastoplasma (pag. 50), sostanza extracellulare dei connettivi, quando è costituita in prevalenza da particolari macromolecole (proteoglicani).

Figura 1.6. Sezione di organo (fegato) colorata con il metodo Ematossilina-Eosina (E-E). I nuclei delle cellule risultano colorati in viola con ematossilina e il citoplasma in rosaaranciato con eosina (da preparato).

Colorazione metacromatica Alcuni coloranti blu basici del gruppo delle tiazine, come il blu di toluidina, possono presentare, in presenza di particolari macromolecole, una caratteristica risposta definita metacromasia. Questo sostantivo esprime il viraggio di colore di questi coloranti che, posti in soluzione acquosa presentano un colore blu ortocromatico, quando invece si legano a taluni composti definiti cromotropi danno luogo alla comparsa di un colore differente cioè ad un fenomeno di metacromasia. In alcuni tessuti in cui sono presenti particolari macromolecole (fig. 1.10), un preparato colorato con il blu di toluidina evidenzia i nuclei in blu (ortocromatici e basofili in quanto di natura acida per gli acidi nucleici) e ampie aree colorate in viola intenso, rosso fino al rosso porpora (metacromatiche e basofile per la presenza di determinate macromolecole, i proteoglicani o mucopolisaccaridi acidi, con numerosi gruppi acidi liberi, responsabili di questa risposta). Un tessuto che si presta a questa osservazione è il tessuto cartilagineo (fig. 1.10): in corso di formazione durante il periodo embrionale e nel tessuto maturo la sostanza intercellulare è altamente metacromatica per la presenza di macromolecole di natura specifica come i proteoglicani.

Figura 1.7. Sezione di organo (esofago) colorata secondo il metodo Azan. I nuclei delle cellule risultano colorati in rosso (azocarminio) e il tessuto connettivo mostra i nuclei delle cellule distribuiti in una sostanza intercellulare colorata in blu.

Figura 1.8. Sezione longitudinale di fibre muscolari striate scheletriche colorate con il metodo Ematossilina ferrica. Le bande trasversali che caratterizzano le fibre sono colorate in grigio e nero.

Figura 1.9. Metodo con Blu di toluidina, colorante basico comunemente impiegato in colorazioni di routine. Il confronta tra questi due campi microscopici mette ben in evidenza una risposta molto differente in termini di intensità di colorazione, dovuta soprattutto allo spessore delle sezione molto diverso. A) Lo spessore è di circa 7-8 μm (da preparato). B) Lo spessore della sezione semifine è di 1 μm (da preparato).

Figura 1.10. Colorazione metacromatica. A) Cellule connettivali (mastociti) con i nuclei in blu (ortocromatici) e granuli metacromatici intorno. B) Tessuto cartilagineo: i nuclei (ortocromatici) delle cellule accolte entro lacune sono indicati da punta di freccia gialla, in viola risultano colorate le aree ricche in proteoglicani.

1.3

Strumenti ottici d’indagine

Il microscopio è lo strumento d’elezione per lo studio della morfologia quando questa sconfina nell’infinitamente piccolo. Esistono molti altri metodi per studiare microrganismi, cellule o i loro componenti, ma la microscopia ha il notevole vantaggio di fornire un’immagine diretta dell’oggetto in esame e non una rappresentazione astratta: una sezione osservata al microscopio ottico non richiede di essere decodificata o interpretata sulla base di un modello predeterminato.

1.3.1 Microscopia ottica

La microscopia ottica convenzionale, la microscopia in contrasto di fase, la microscopia in luce polarizzata, la microscopia confocale e la microscopia in fluorescenza sono tutte basate sulle interazioni tra i fotoni e i componenti dei tessuti e possono essere utilizzateper evidenziare e studiare le caratteristiche dei tessuti. Le varietà di microscopi appena citate hanno un largo impiego in campo biologico e forniscono informazioni più mirate in base al tipo di materiale biologico esaminato: in questa sede, per necessità didattiche, approfondiremo le principali caratteristiche del microscopio ottico composto.

Microscopio ottico composto (MO) - Nei laboratori di istologia il microscopio comunemente utilizzato per diagnosi morfologiche è il microscopio ottico composto, per l’osservazione a luce trasmessa o "in campo chiaro". I preparati istologici opportunamente allestiti vengono esaminati per mezzo della luce ordinaria che attraversa la sezione di tessuto. Esso risulta costituito da: a) lo stativo che funge da supporto alla parte ottica; b) il sistema di illuminazione che comprende la sorgente luminosa e il condensatore; c) il sistema ottico rappresentato da due serie di lenti, l’obiettivo e l’oculare (fig. 1.11).

Figura 1.11. Microscopio ottico composto.

Il sistema di illuminazione è solitamente posto in basso: il fascio luminoso viene raccolto dal condensatore che lo concentra focalizzando la luce e producendo un cono di luce che illumina il tessuto sul vetrino posto sul tavolino traslatore. La sezione di tessuto colorata modifica la luce secondo la possibilità delle sue varie parti di assorbire determinate lunghezze d’onda: il fascio luminoso subisce pure modificazioni di cammino e di velocità dovuti ai differenti indici di rifrazione dei vari componenti del preparato. Il fascio luminoso che esce dal preparato incontra il primo sistema di lenti costituito dall’obiettivo: tali lenti forniscono una immagine reale, ingrandita e capovolta che cade su un piano posto fra l’obiettivo e l’oculare. L’oculare si comporta, rispetto a questa immagine, come una semplice lente d’ingrandimento e proietta quindi sulla retina dell’osservatore, su uno schermo, su una lastra fotografica ecc. un’ immagine virtuale, ulteriormente ingrandita e sempre capovolta (fig. 1.12). L’ingrandimento complessivo è dato dal prodotto degli ingrandimenti propri dell’obiettivo e dell’oculare (riportati sulla superficie esterna degli stessi) e ha limiti dipendenti dalla lunghezza d’onda utilizzata, dall’indice di rifrazione del mezzo e dall’apertura dell’obiettivo.

Un primo parametro che permette di ottenere con il microscopio ottico un’immagine nitida e dettagliata è il potere di risoluzione cioè la distanza minima alla quale due punti possono essere visti come distinti. La caratteristica più importante di un microscopio ottico è perciò la capacità di risolvere i dettagli più fini di un preparato mostrando separati punti fra loro molto vicini.

Figura 1.12. Schema di composizione delle immagini nel microscopio ottico composto:

og: oggetto

ob: obiettivo

oc: oculare

Fob: fuoco dell’obiettivo

Foc: fuoco dell’oculare

I1 A′- B′ :

immagine reale ingrandita e capovolta

I2 A″- B″:

immagine virtuale ingrandita e capovolta.

Il potere di risoluzione è espresso dalla seguente formula di Abbe:

ε = λ / 2n sen α

dove ε indica il potere risolutivo; λ è la lunghezza d’onda; n è l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra l’oggetto e l’obiettivo e α rappresenta l’apertura numerica dell’obiettivo. Nei comuni obiettivi a secco l’indice di rifrazione dell’aria, interposta tra preparato e obiettivo, è uguale a 1: per poter aumentare il potere risolutivo, disponendo così di maggiori ingrandimenti, si usano obiettivi a immersione omogenea interponendo una goccia di olio di legno di cedro, che ha un indice di rifrazione quasi uguale a quello del vetro, fra la lente dell’obiettivo e il preparato. I raggi luminosi uscendo dal preparato percorrono così un sistema otticamente omogeneo poiché il vetrino su cui è racchiusa la sezione, l’olio ad immersione e il cristallo delle lenti hanno un indice di rifrazione con lo stesso valore. Il massimo potere di risoluzione del microscopio ottico è approssimativamente 0.2 µm e permette di vedere delle buone immagini anche a ingrandimenti pari a 1000 – 1500 volte. La qualità dell’immagine come nitidezza e ricchezza di particolari dipende dal potere di risoluzione legato principalmente alla qualità delle lenti degli obiettivi mentra l’oculare ingrandisce solo l’immagine senza modificare altre variabili.

Un secondo parametro che definisce l’osservazione al microscopio ottico è l’ingrandimento. Questo valore è il risultato di un rapporto tra la dimensione dell’immagine al microscopio e la dimensione reale dell’oggetto. Applicando le leggi dell’ottica geometrica ricaviamo che l’ingrandimento complessivo è dato dal prodotto degli ingrandimenti propri dell’obiettivo e dell’oculare:

I totale = I obiettivo × I oculare

Passando quindi all’uso del microscopio ottico nel corso delle osservazioni di routine, per ricavare informazioni articolate, si impiegano comunemente oculari 10x e un corredo di obiettivi con tre ingrandimenti successivi:

a)   in genere si parte da un obiettivo a piccolo ingrandimento (4x oppure 10x) per ricavare immagini d’insieme osservando ampie aree di tessuto: obiettivo 10x con oculare 10x = 100x ingrandimento finale;

b)   si passa poi ad un obiettivo a medio ingrandimento (10x oppure 25x) per analizzare campi più piccoli e descrivere l’organizzazione cellulare dei tessuti: obiettivo 25x con oculare 10x = 250x ingrandimento finale;

c)   infine si osserva con un obiettivo a forte ingrandimento (40x oppure 63x) per riconoscere particolari e dettagli citologici: obiettivo 63x con oculare 10x = 630x ingrandimento finale.

Una terza variabile che incide sulla bontà dell’osservazione al microscopio ottico è rappresentato dal contrasto: questo parametro dipende dalle differenze di assorbimento della luce.

Dopo avere affrontato e chiarito le tecniche di allestimento dei preparati istologici e le caratteristiche dell’osservazione al microscopio ottico, è ora possibile, in caso di lettura di un preparato istologico, applicare le conoscenze acquisite e, grazie alla colorazione al MO, si possono ricavare numerose informazioni non solo dal punto di vista morfologico ma anche tintoriale. Quando il preparato è di buona qualità la morfologia e l’affinità tintoriale delle strutture cellulari risultano fondamentali ai fini di una diagnosi di tessuto e di organo: sarà necessario descrivere i campi microscopici con terminologia adeguata, tenendo conto sia delle caratteristiche morfologiche e di collocazione di alcune componenti cellulari in regioni ben definite (es. forma e posizione dei nuclei) sia delle affinità tintoriali del citoplasma (basofilia e acidofilia).

1.3.2 Microscopia elettronica

La microscopia elettronica a trasmissione e la microscopia elettronica a scansione sono basate sulla interazione degli elettroni con le varie componenti dei tessuti. La lunghezza d’onda del fascio di elettroni è più corta di quella della luce: una λ molto piccola inserita nella formula di Abbe, fornisce un limite di risoluzione teorico molto più piccolo di quello del microscopio luce ordinario. Questo è il principio su cui si basa la microscopia elettronica, la cui applicazione ha permesso di estendere le ricerche in campo ultrastrutturale.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Il microscopio elettronico a trasmissione è uno strumento che permette l’osservazione diretta della ultrastruttura di cellule e tessuti: infatti può raggiungere un numero molto elevato di ingrandimenti (100.000x) e ha un potere di risoluzione di circa 3,5 nm. Questa elevata risoluzione consente ingrandimenti molto forti che permettono di osservare dettagli particolarmente fini. Il TEM si basa sul principio che un fascio di elettroni può essere deviato da un campo magnetico. Gli elettroni emessi da un catodo (filamento metallico incandescente in tungsteno) posto all’apice della colonna dello strumento, vengono accelerati da una forte differenza di potenziale e attratti dall’anodo (piastra metallica con un piccolo foro al centro): si genera così un fascio di elettroni indirizzati lungo la colonna. Poiché gli elettroni modificano il loro percorso se sottoposti ad un campo elettromagnetico, il fascio viene focalizzato dal passaggio attraverso delle bobine magnetiche, che possono essere considerate come lenti elettromagnetiche. L’immagine finale viene osservata su uno schermo fluorescente e può essere registrata su lastra fotografica: l’intero cammino degli elettroni avviene in una colonna in cui è stato creato il vuoto assoluto (fig. 1.13).

Figura 1.13. Microscopio elettronico (A) e percorso del fascio di elettroni (B).

È possibile variare in modo continuo l’ingrandimento del microscopio elettronico variando il campo magnetico delle lenti. La prima lente agisce come un condensatore che focalizza il fascio di elettroni sulla sezione da esaminare. Alcuni elettroni interagiscono con gli atomi presenti nel campione e continuano il loro cammino, mentre altri attraversano semplicemente il campione senza interagire con esso. Gli elettroni che attraversano il campione raggiungono le lenti dell’obiettivo, le quali formano un’immagine ingrandita e focalizzata che viene ulteriormente ingrandita da altre lenti. Poiché l’occhio umano non è sensibile agli elettroni, l’immagine viene infine formata su uno schermo fluorescente posto alla base della colonna entro cui hanno viaggiato gli elettroni: in questo modo si rende visibile l’immagine elettronica convertendo il fascio di elettroni in luce visibile.

In una micrografia elettronica le aree del campione attraversate dagli elettroni appaiono chiare o elettrontrasparenti, mentre quelle naturalmente dense o che abbiano legato metalli pesanti durante la preparazione, appaiono scure o elettrondense. L’immagine del campione perciò mostra aree bianche e nere e ombre di grigio e deve essere descritta con opportuna terminologia che tiene conto del comportamento degli elettroni nell’attraversare un campione biologico (fig. 1.15). Per ottenere delle micrografie al TEM di buona qualità sono richieste sezioni molto sottili (50-100 nm) per cui l’inclusione dei campioni viene eseguita in resina epossidica (dura) e il taglio richiede l’impiego di ultramicrotomo con lama di vetro o diamante (fig. 1.14). Le sezioni, dopo essere state raccolte su griglie di metallo aventi un diametro di pochi mm (retini in rame o anellini), sono pronte per essere collocate nel sito predisposto all’interno della colonna.

Figura 1.14. Ultramicrotomo (A) e zona di lavoro dello stesso (B): la freccia indica la lama di vetro.

Microscopio elettronico a scansione (SEM) – Il microscopio elettronico a scansione permette una visione pseudotridimensionale per una eccezionale profondità di campo. Questo strumento può dare un’ampia gamma di ingrandimenti (fino a 100.000x) e ha un potere di risoluzione da 10 a 20 nm. Il microscopio elettronico a scansione è in grado di fornire immagini della superficie degli oggetti in quanto il fascio di elettroni non attraversa il campione ma ne esplora la superficie con un ben preciso angolo di incidenza, oscillando ripetutamente (movimento di scansione o scanning) in forma di pennello di elettroni. La superficie del campione, rivestita precedentemente da uno strato molto sottile di atomi di metalli (che impediscono il passaggio degli elettroni), dà origine ad elettroni secondari: questi ultimi vengono raccolti da placchette collettrici e inviati ad un sistema elettronico collegato al sistema di scansione del fascio primario. I segnali così ottenuti e amplificati vengono inviati ad un monitor su cui si forma un’immagine finale in bianco e nero. Le micrografie risultanti dall’osservazione con il SEM rendono una notevole profondità del campo: gli effetti ottici che ne derivano danno all’osservatore l’impressione di una struttura tridimensionale pur trattandosi di fotografie bidimensionali (fig. 1.15).

Figura 1.15. Confronto tra cellule nervose osservate al microscopio elettronico a trasmissione e a scansione. A) Aspetto al TEM (2500x – da preparato). B) Aspetto al SEM (4000x – da preparato).

1.4

Autoradiografia

L’autoradiografia (o autoistoradiografia) è un metodo importante per rilevare l’utilizzazione, nel corso dei processi vitali della cellula e dei tessuti, di sostanze specifiche (isotopi radioattivi) introdotte nell’organismo e metabolizzate dalle cellule. Il risultato consiste nella rivelazione della distribuzione di radioattività in un campione di tessuto per mezzo di emulsioni fotografiche.

Nell’applicazione biologica si usano isotopi radioattivi veicolati da una opportuna molecola chimica che di solito è un precursore specifico della sostanza da studiare (timidina – H³ come precursore del DNA, aminoacidi – H³ come precursori di proteine ecc.). Il precursore radioattivo specifico viene somministrato all’animale per iniezione oppure viene aggiunto al mezzo nutritivo di una coltura cellulare: le molecole in corso di sintesi al momento della somministrazione incorporano il precursore radioattivo diventando così radioattive e possono essere localizzate nella cellula o nel tessuto per mezzo della autoradiografia. Dopo il prelievo i frammenti di tessuto contenenti materiale radioattivo vengono fissati, inclusi e tagliati in sottili sezioni: queste vengono poste in contatto con un sottile strato di emulsione fotografica (fig. 1.16). Durante il periodo di esposizione del preparate le particelle ionizzanti emesse dal composto radioattivo colpiscono l’emulsione producendo un’immagine latente che viene rivelata da comuni tecniche di sviluppo e fissaggio.

Le autoradiografie sono preparati nei quali particelle di granuli d’argento indicano le regioni cellulari in cui specifiche molecole sono sintetizzate appena prima della fissazione: le piccole regioni esposte sono così rivelate sotto forma di granuli d’argento a seguito dello sviluppo del preparato come se fosse una pellicola fotografica, seguito dall’osservazione al microscopio. Il procedimento descritto può essere impiegato sia per la microscopia ottica sia per quella elettronica.

Figura 1.16. Schema delle principali tappe dell’autoradiografia.

Il metodo quindi rivela la localizzazione solo di quei componenti chimici che sono metabolicamente attivi nel periodo di somministrazione del precursore marcato. La tecnica istoradiografica rende possibile lo studio della dinamica dei processi metabolici cellulari e affianca le classiche metodiche istochimiche.

1.5

Istochimica

I metodi di colorazione accennati precedentemente non possono dare informazioni precise sulla natura chimica dei composti contenuti nelle cellule. Queste indicazioni si possono ottenere sottoponendo le sezioni di tessuti a vere e proprie reazioni chimiche che, senza danneggiare le strutture cellulari, danno luogo a prodotti colorati non diffusibili che identificano in situ le sostanze chimiche nelle loro normali sedi cellulari.

Tra i metodi di studio merita quindi un cenno particolare l’Istochimica: tale disciplina si è affermata nell’ambito dell’Istologia e ha creato spesso contrasti tra i suoi convinti sostenitori e accesi detrattori. Sostenitori sono stati, soprattutto nella seconda metà del secolo scorso gli istologi classici e i morfologi, mentre i chimici puri e i biologi molecolari hanno spesso fortemente criticato la validità dei metodi istochimici applicati allo studio della morfologia. Il biologo L. Lison nel 1936 sintetizzò nella seguente semplice espressione il significato e la finalità dell’istocliiniica: l’Istochimica si propone di rendere l’immagine chimica di cellule e tessuti. È importante quindi confrontare le finalità di scienze affini per il risultato ma molto lontane per le metodiche applicate: la morfologia e la biochimica (tabella 1.3).

L’istochimica si è comunque affermata come metodo di studio non solo nello studio delle localizzazioni microscopiche ma si sta anche estendendo a livello ultrastrutturale. Per l’indagine istochimica è importante che durante l’allestimento del preparato non avvenga l’estrazione o la dislocazione del componente chimico da esaminare: per questo motivo assumono quindi grande importanza la scelta del fissativo e del mezzo di inclusione. La comunità scientifica internazionale ha indicato dei criteri di validità per uno studio di tipo istochimico sia nell’ambito dell’indagine microscopica sia nell’indagine ultrastrutturale. Tali criteri si riassumono nei seguenti punti:

•   La preparazione dei tessuti non deve modificare topograficamente o chimicamente le componenti oggetto di studio.

•   Le sezioni allestite, pur consentendo il passaggio della luce, non devono alterare la morfologia tissutale.

•   Il metodo impiegato deve essere specifico per la sostanza o il gruppo chimico che si intende studiare.

•   Le sostanze che si intendono esaminare non devono diffondere dalle loro localizzazioni originarie: i reagenti impiegati nel corso delle reazioni chimiche non devono comportare la solubilizzazione, la diffusione o la dislocazione sia della sostanza analizzata sia del prodotto di reazione.

•   Il prodotto della reazione deve essere insolubile e colorato (se l’osservazione sarà condotta al microscopio ottico) oppure elettrondenso.

Esistono metodi per ciascun gruppo di composti: glucidi, lipidi, proteine, acidi nucleici, enzimi, pigmenti e componenti inorganici. Il riconoscimento di queste sostanze richiede in genere l’evidenziazione di radicali o frazioni chimiche che le caratterizzano e il prodotto della reazione chimica è di solito apprezzabile in quanto colorato. In questa sede rivediamo brevemente solo alcuni metodi istochimici che verranno citati nel corso del testo, in quanto hanno avuto un ruolo importante per arricchire le conoscenze di cellule e tessuti.

Metodo PAS - Il metodo PAS (Periodic Acid-Schiff) è sicuramente il più applicato e noto in ambito istologico: questa reazione rivela, colorando in rosso porpora, i glucidi come polisaccaridi in genere, glicogeno, glicoproteine e mucopolisaccaridi neutri (fig. 1.17). La dimostrazione istochimica del glicogeno è particolarmente ostacolata dalla sua rapida solubilizzazione in acqua dopo morte cellulare. Per la miglior conservazione in loco del glicogeno la fissazione deve avvenire su tessuto freschissimo e consentire il mantenimento dei legami in vivo. La presenza del glicogeno deve essere confermata dal confronto di due sezioni distinte dello stesso tessuto: su una viene applicato direttamente il metodo PAS, sull’altra la reazione PAS viene applicata dopo pretrattamento con un enzima che scinde il glicogeno (amilasi).

Figura 1.17. Reazione PAS applicata a tessuti diversi: la componente glucidica o glicoproteica appare colorata in rosso porpora.

A) Mucosa gastrica: la positività alla reazione è dovuta alla mucina presente lungo tutto il margine superficiale (punta di freccia nera) e a cellule che compongono le ghiandole della mucosa (punta di freccia gialla).

B) Epitelio intestinale: le zone colorate in rosso porpora (punte di freccia) sono PASpositive per la presenza di glucidi (glicoproteine).

C) Epitelio stratificato: il citoplasma è ricco di glicogeno, opportunamente conservato, colorato in rosso porpora (da preparato).

Reazione di Feulgen - La reazione di Feulgen permette invece la localizzazione del DNA (acido nucleico) ed è altamente specifica. Il principio si basa sulla dimostrazione del desossiribosio (pentoso specifico del DNA): i nuclei appaiono colorati in rosso porpora per la presenza del DNA (fig. 1.18). Questo metodo ha permesso sia di distinguere il DNA dall’RNA, sia di identificare strutture poco chiare dal punto di vista morfologico, quali grosse granulazioni citoplasmatiche, nuclei o componenti di altro genere.

Colorazione elettiva per i lipidi - Le colorazioni elettive per i lipidi impiegano come metodo generico dei coloranti liposolubili quali il Sudan III, che colora i lipidi in arancione, e il Sudan nero B, che colora i lipidi in blu-nero (fig. 1.18). Dopo aver osservato tutte le precauzioni per la loro conservazione, quali la fissazione per congelamento e il taglio al microtomo congelatore o al criostato, i lipidi possono essere evidenziati da coloranti liposolubili o lisocromi i quali non reagiscono chimicamente con i lipidi ma si sciolgono in essi.

La colorazione che i lisocromi conferiscono ai lipidi dipende dal fatto che, essendo portatori di un gruppo cromoforo, solubilizzandosi nelle sostanze lipidiche cedono loro la propria colorazione. Infatti il loro meccanismo d’azione si basa sul principio di solubilità differenziale in quanto il colorante passa da un mezzo meno favorevole (solvente) ad uno per il quale presenta maggiore affinità (i lipidi tissutali). È importante precisare che il Sudan Nero B, rispetto agli altri Sudan, evidenzia un maggior numero di categorie di lipidi (fosfolipidi e glicolipidi).

Figura 1.18. A) Reazione di Feulgen: solo i nuclei sono risultati positivi al metodo assumendo color rosso porpora. B) Cellule epatiche con lipidi colorati in blu-nero con il Sudan nero B.

Metodi per le proteine - Per completare questa rapida panoramica sui principali metodi istochimici ricordiamo che la localizzazione delle proteine richiede la dimostrazione della presenza dei gruppi radicali attivi dei diversi aminoacidi.

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