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    Selezione di reference genes per la quantificazione dell'espressione genica mediante qRT-PCR in Salmonella enterica
    Selezione di reference genes per la quantificazione dell'espressione genica mediante qRT-PCR in Salmonella enterica
    Selezione di reference genes per la quantificazione dell'espressione genica mediante qRT-PCR in Salmonella enterica
    Ebook96 pages48 minutes

    Selezione di reference genes per la quantificazione dell'espressione genica mediante qRT-PCR in Salmonella enterica

    By Dott. Valerio D'antonio

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    About this ebook

    Il seguente lavoro di ricerca è nato dall’esigenza di selezionare da un assortimento di geni housekeeping di un ceppo di Salmonella enterica, noto enteropatogeno, dei geni costitutivi tali da poter essere impiegati come standard interni al fine di permettere, negli studi che hanno ad oggetto la valutazione dell’espressione genica di geni target, dei risultati sperimentali di più elevata validità scientifica, in quanto dotati di un maggior grado di accuratezza e precisione.
    Da alcuni anni a questa parte, l’utilizzo delle tecniche di diagnostica molecolare, tra cui la Real-Time PCR quantitativa, hanno trovato un crescente impiego, oltre che nella ricerca e nella diagnostica clinica, anche nella discriminazione molecolare dei microrganismi contaminanti le matrici alimentari e ambientali.
    Trovare geni reference adatti che offrono la possibilità di valutare con un alto grado di sensibilità e specificità l’espressione genica non è un’impresa semplice, in quanto oltre a dover essere specie-specifici, devono possedere anche un elevato grado di stabilità genica, ossia, i geni che si intende utilizzare come standard interni per la quantificazione dell’espressione genica non devono risentire delle diverse condizioni sperimentali a cui sottoponiamo le nostre colture cellulari. Risulta quindi chiaro che, ad ogni condizione sperimentale e linea cellulare impiegata, si necessita di trovare almeno due o tre geni reference che appartengano alla linea cellulare in questione e che allo stesso tempo presentino un certo grado di stabilità nella/e condizione/i sperimentale/i utilizzata/e.
    Questo accorgimento permette di ridurre al minimo gli errori sistematici, quali sottostime e sovrastime, durante le analisi molecolari effettuate attraverso metodologia qRT-PCR. Un buon valore di stabilità genica inoltre, permette una più accurata normalizzazione dei dati.
    In questo studio è stata considerata una coltura cellulare omogenea di Salmonella enterica sottoposta a tre differenti condizioni sperimentali, oltre all’esposizione della stessa ad un antimicrobico naturale, nel nostro caso rappresentato dal timolo, un noto olio essenziale.
    LanguageItaliano
    PublisherDott. Valerio D'antonio
    Release dateAug 28, 2012
    ISBN9788867550647
    Selezione di reference genes per la quantificazione dell'espressione genica mediante qRT-PCR in Salmonella enterica

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      Selezione di reference genes per la quantificazione dell'espressione genica mediante qRT-PCR in Salmonella enterica - Dott. Valerio D'antonio

      BIBLIOGRAFIA

      1. INTRODUZIONE

      1.1– Salmonella: biologia e patologia umana trasmessa da alimenti

      Salmonella è un batterio Gram negativo della famiglia enterobacteriaceae, anaerobio facoltativo, asporigeno, cresce bene ad un pH attorno a 7, ad una temperatura attorno ai 35°, e a concentrazioni di NaCl massime del 10%.

      E’ un batterio mobile in quanto provvisto di flagelli peritrichi, e in base alla capacità di motilità, il microrganismo viene indicato di fase I se capace di muoversi, o di fase II se incapace di muoversi.

      Salmonella risulta essere un microrganismo chemio-organotrofo in quanto effettua reazioni di ossido-riduzione per ricavare energia da composti organici; la maggior parte delle specie produce idrogeno solfato da queste reazioni metaboliche.

      Fig. 1: Salmonella enterica: morfologia al Microscopio Elettronico a Trasmissione.

      Questo batterio è responsabile di infezioni gastrointestinali dette salmonellosi; questa condizione è causata da oltre 2000 sierotipi di salmonella, e si manifesta come una gastroenterite acuta (specialmente nei bambini) veicolata da alimenti (carni, uova, latte e derivati, dolciumi…), in particolar modo le carni possono venire contaminate sia quando l’animale è vivo, sia dopo la sua morte attraverso il personale addetto alla lavorazione nei macelli, mentre il latte in genere si contamina subito dopo la mungitura.

      Questa malattia infettiva ha in genere una maggior incidenza estiva, ha una bassa letalità (1%) ma sono frequenti i carrier cronici (circa l’1% della popolazione), inoltre i serbatoi come abbiamo visto, possono essere anche gli animali (in particolare bovini, suini, pollame, equini…).

      Può essere causa di una tossinfezione che in genere ha incubazione di circa un giorno e dura in media cinque giorni, caratterizzata da sintomi gastrointestinali e febbre (ma ciò dipende anche dall’invasività e dalla virulenza del ceppo, dallo stato immunitario dell’ospite e dalla carica microbica infettante).

      Alcuni suoi sierotipi di frequente riscontro, tra cui S. thyphii e parathyphii (A, B, C) provocano rispettivamente il tifo e il paratifo, entrambe malattie acute e contagiose a trasmissione oro-fecale che colpiscono solo l’uomo, pertanto gli alimenti che contengono il batterio sono quelli venuti a contatto con materiale fecale di soggetti malati o portatori.

      Questa tossinfezione se acquisita, risulta curabile con terapia sintomatica; la prevenzione in genere mira all’igiene degli alimenti e degli allevamenti.

      Ci sono molte similitudini tra Salmonella ed E.Coli per quanto riguarda i loro geni housekeeping; salmonella (circa 2400 sierotipi) contiene delle isole di patogenicità (SP1-SP4) responsabili dei suoi processi patogenetici, da 6 a 12 operoni codificanti per fimbrie/adesine (pili),e svariati antigeni come l’antigene O dei lipopolisaccaridi (LPS) e gli antigeni flagellari (fliB e fliC) di fase I e II.

      Il suo plasmide di virulenza porta alcuni geni fondamentali per l’insediamento e la persistenza nel sistema reticolo-endoteliale del suo ospite.

      Le infezioni causate dai batteri del genere Salmonella si designano con il termine di salmonellosi.

      Si possono manifestare con quadri clinici diversi, che comprendono in alcuni casi anche una fase sistemica (febbre tifoide, paratifi, infezioni extraintestinali), mentre in altri sono caratterizzati dalla primitiva ed esclusiva localizzazione al tubo digerente (enterocoliti).

      Comuni sono le infezioni asintomatiche e la condizione di portatore sano transitorio o cronico con frequente localizzazione del batterio a livello colecistico.

      Una volta che il batterio penetra nell’organismo attraverso l’acqua o gli alimenti contaminati, invade gli enterociti; alcuni ceppi di salmonella invadono le cellule M (Macrofagi intestinali), attraversano il tessuto linfoide e vengono fagocitate dai fagociti, altri invece provocano il rilascio di citochine infiammatorie dalle cellule epiteliali con conseguente infiltrazione di neutrofili.

      Se invadono le cellule M si genera la febbre enterica, se invece invadono gli enterociti si può avere setticemia e batteriemia e si opta per un trattamento antibiotico (J Maurer et al. 2005).

      Fig. 2: Meccanismi patogenetici innescati da Salmonella a livello intestinale.

      Una volta penetrata nell’organismo per via orale, S.typhii supera la barriera gastrica e giunge nell’intestino tenue, dove aderisce agli enterociti e alle cellule M, gli elementi epiteliali disposti al di sopra delle placche di Peyer, che costituiscono il bersaglio iniziale del batterio.

      Invase le cellule epiteliali, i batteri vengono trasportati attraverso di esse fino

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