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Morte cellulare programmata indotta da acido acetico in Saccharomyces cerevisiae: produzione di ROS e rilascio di citocromo c
Morte cellulare programmata indotta da acido acetico in Saccharomyces cerevisiae: produzione di ROS e rilascio di citocromo c
Morte cellulare programmata indotta da acido acetico in Saccharomyces cerevisiae: produzione di ROS e rilascio di citocromo c
Ebook64 pages38 minutes

Morte cellulare programmata indotta da acido acetico in Saccharomyces cerevisiae: produzione di ROS e rilascio di citocromo c

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La ricerca ha messo in evidenza l’esistenza di un fenomeno di morte cellulare programmata negli organismi unicellulari, in particolare nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato utilizzato per ricostituire, in un sistema eucariotico semplice, l’apparato molecolare del processo di morte per apoptosi dei metazoi. L’induzione della morte è stata effettuata in un medium acido in cui è aggiunto acido acetico 80 mM. Dal punto di vista biotecnologico, l’acido acetico, come altri acidi deboli, è un potente agente fungistatico utilizzato per la conservazione di cibi e bevande in quanto previene la crescita microbica. Inoltre, il lievito è dotato di un sistema di risposta agli acidi deboli finalizzata a ridurre l’accumulo di questi ultimi: perciò, l’induzione della morte di cellule di lievito con acido acetico rappresenta un sistema sperimentale simile ad una condizione che si verifica fisiologicamente rispetto a sistemi in cui si utilizzano come induttori di morte sostanze dannose e tossiche. Per analizzare se durante la morte indotta da acido acetico si verifica il fenomeno della condensazione cromatinica, le cellule trattate con acido acetico a vari tempi sono state sottoposte a doppia colorazione con 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocloride (DAPI) e con ioduro di propidio (PI) ed in seguito osservate al microscopio a fluorescenza. Il sistema cellulare così analizzato ha messo in evidenza la condensazione cromatinica già a tempi precoci. In tutti gli esperimenti effettuati si è osservata prevenzione della morte da cicloesimmide. Successivamente si è analizzata la produzione di ROS durante il processo di morte indotto da acido acetico. Le cellule di lievito trattate con acido acetico sono state incubate con i reagenti 2,7-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCF-DA), un composto fotosensibile utilizzato per misurare la produzione di acqua ossigenata nelle cellule, e diidroetidio (DHE), un composto fotosensibile permeabile alle cellule utilizzato per rivelare la presenza di superossido nelle cellule. È dimostrato che si forma acqua ossigenata già a tempi precoci dopo trattamento con acido acetico e si ha accumulo di anione superossido a tempi tardivi dopo l’induzione della morte con acido acetico. Suggerendo un ruolo del perossido d’idrogeno in questo tipo di morte. Il citocromo c è rilasciato nel citoplasma dallo spazio intermembrana
LanguageItaliano
Release dateJan 25, 2012
ISBN9788863696127
Morte cellulare programmata indotta da acido acetico in Saccharomyces cerevisiae: produzione di ROS e rilascio di citocromo c

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    Morte cellulare programmata indotta da acido acetico in Saccharomyces cerevisiae - Barbara Lacitignola

    Vincenzo

    1. INTRODUZIONE

    L’apoptosi è una forma di morte cellulare, distinta dalla necrosi, determinata geneticamente e caratterizzata da specifiche modificazioni cito-morfologiche e biochimiche (Kerr et al., 1972). È descritta per la prima volta dopo i primi anni settanta da Kerr insieme a Wyllie e Currie. Differentemente dalla necrosi, che è un evento patologico provocato da una grave lesione della membrana plasmatica, la cellula apoptotica riduce il suo volume (shrinkage) e perde il contatto con le cellule vicine. Essa interessa una varietà di processi biologici ed è importante nello sviluppo dei tessuti e nella difesa immunitaria (Wyllie et al., 1980); in più, un difetto nella sua regolazione può portare alla formazione di cellule cancerose, di malattie neurodegenerative e della maggior parte delle patologie cardiovascolari (Thompson, 1995).

    Le prime fasi del processo di apoptosi non comportano la perdita dell’organizzazione interna della cellula, ma a livello nucleare si verifica la disgregazione del nucleolo, la condensazione della cromatina, che migra verso la periferia del nucleo, e la frammentazione del DNA da parte di endonucleasi che originano frammenti di 180-200 bp e loro multipli interi (DNA laddering). In seguito, il materiale nucleare raggiunge la membrana plasmatica dove viene circondato da invaginazioni della membrana stessa, che conferisce alla cellula un aspetto a bolla (blebbing): queste bolle si staccano dal corpo cellulare e vanno a costituire i corpi apoptotici. La membrana plasmatica subisce un’alterazione della normale asimmetria fosfolipidica con l’esposizione della fosfatidilserina sul lato esterno. Questa alterazione rende possibile il riconoscimento e la successiva eliminazione dei corpi apoptotici che vengono incorporati e digeriti da macrofagi o da cellule adiacenti; inoltre, sempre durante l’apoptosi, non si verifica versamento di contenuto citosolico nell’ambiente extracellulare e non si innesca una risposta infiammatoria nel tessuto.

    Molti dei cambiamenti morfologici osservati nelle cellule apoptotiche sono causati da una famiglia di proteasi, note come caspasi. Le caspasi, in risposta a segnali apoptotici, provocano le modificazioni strutturali tipiche che la cellula subisce in questo tipo di morte; esse sono delle proteasi a cisteina che tagliano i substrati in corrispondenza dei residui di acido aspartico delle proteine bersaglio. Fino ad oggi, nei mammiferi sono state identificate almeno una dozzina di caspasi, ed in base al loro ruolo sono state suddivise in tre gruppi funzionali: caspasi iniziatrici, caspasi effettrici e caspasi coinvolte nei processi infiammatori. Le caspasi esistono sotto forma di proenzimi e sono attivate per mezzo di un taglio proteolitico che innesca un processo a cascata che si risolve nella degradazione dei substrati finali; quindi, le caspasi hanno un ruolo decisivo nelle modificazioni strutturali a cui va incontro la cellula durante la morte cellulare programmata.

    La morte per apoptosi può essere attivata da segnali esterni e mediata da recettori localizzati sulla membrana plasmatica oppure può essere indotta da varie forme di stress e mediata dal mitocondrio. Uno dei recettori caratterizzati è Fas, che appartiene alla famiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale TNF-R e che, se in passato era indicato come APO-1, ora è classificato come CD95. In seguito al legame con il suo ligando specifico, il complesso Fas-ligando (Fas-L) determina l’aggregazione dei monomeri Fas a livello della membrana cellulare, che innesca una via di traduzione del segnale che si conclude con la morte per apoptosi (Nagata et al., 1995). L’aggregato attrae una proteina del citosol

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