Caratterizzazione funzionale di CRK20, un recettore chinasico cysteine-rich di Arabidopsis

cellula.

INDICE

1. INTRODUZIONE

1.1   I RECETTORI CHINASICI NEGLI ANIMALI E NELLE PIANTE

1.2   I RECETTORI SERINA/TREONINA CHINASICI E LA RISPOSTA DELLE PIANTE

1.3   LE RLK s DELLE PIANTE

1.3.1 L’origine e l’evoluzione

1.3.2 La struttura e la classificazione

1.3.3 Il meccanismo di funzionamento

1.3.4 Le proteine che interagiscono con le RLKs

1.3.5 Le funzioni delle RLKs

1.3.5.1   Le RLKs e lo sviluppo della pianta

1.3.5.2   Le RLKs e la difesa della pianta: lo stress biotico

1.3.5.3   Le RLKs e la difesa della pianta: lo stress abiotico

1.3.6 L’espressione delle RLKs

1.4   LE CYSTEINE RICH RECEPTOR-LIKE KINASES

1.4.1 La struttura della famiglia

1.4.2 La funzione delle CRKs

1.4.3 Le CRKs e i fattori WRKY

1.4.4 Le proteine che interagiscono con le CRKs

2. SCOPO DELLA TESI

3. MATERIALI E METODI

3.1   MATERIALE VEGETALE

3.2   SEMINA E CRESCITA DELLE PIANTE

3.3   SELEZIONE DEI MUTANTI LOSS OF FUNCTION

3.3.1 Estrazione del DNA

3.3.2 Genotipizzazione

3.4   TRATTAMENTO CON L’OZONO

3.4.1 Esposizione all’ozono

3.4.2 Valutazione del danno: ion leakage

3.5   TRATTAMENTO CON PSEUDOMONAS SYRINGAE

3.5.1 Preparazione dell’inoculo

3.5.2 Infiltrazione della sospensione batterica

3.5.3 Determinazione della crescita batterica

3.6   TRATTAMENTO CON FUSARIUM GRAMINEARUM

3.7   ISOLAMENTO DELL’RNA

3.7.1 Estrazione dell’RNA

3.7.2 Decontaminazione dal DNA

3.8   RT-PCR E ANALISI DELL’ESPRESSIONE GENICA

3.9   ESTRAZIONE E DOSAGGIO DEL SALICILATO

3.9.1 Estrazione del salicilato

3.9.2 Dosaggio del salicilato in HPLC

3.10   ANALISI STATISTICA

3.11   ANALISI BIOINFORMATICA

3.11.1 Identificazione dei geni co-espressi con CRK20

3.11.2 Identificazione degli stimoli che inducono l’espressione differenziale dell’ECGG

3.11.3 Analisi del promotore: cis-elements confermati sperimentalmente

4. RISULTATI E DISCUSSIONE

4.1   L’ESPRESSIONE DI CRK20 E CRK11 E’ INDOTTA DAGLI STRESS BIOTICI ED ABIOTICI IN COL-0

4.2   SELEZIONE DEI MUTANTI KNOCK OUT

4.3   CRK20 NON INFLUENZA LA CRESCITA E LO SVILUPPO

4.4   IL MUTANTE CRK20 E LA RISPOSTA ALL’OZONO

4.4.1 Gli effetti dello stress ossidativo

4.4.2 Ozono e modulazione dell’espressione genica

4.4.2.1   La difesa dalle ROS

4.4.2.2   La via salicilato dipendente

4.4.2.3   La via dell’etilene

4.4.2.4   MAPKs e fattori di trascrizione WRKY

4.5   IL MUTANTE CRK20 E LA RISPOSTA A PSTDC3000

4.5.1 La crescita di PstDC3000 è inibita nel mutante crk20

4.5.2 Implicazione della via del salicilato

4.6   LA RISPOSTA A FUSARIUM GRAMINEARUM UK1

4.7   CONTRIBUTO DELL’ANALISI BIOINFORMATICA ALLA COMPRENSIONE DEL RUOLO FUNZIONALE DEL RECETTORE CRK20

4.7.1 Identificazione dei geni co-espressi con CRK20

4.7.2 Gli stimoli biotici e abiotici e l’ espressione di CRK20

4.7.3 Analisi del promotore

5.   CONCLUSIONI

-BIBLIOGRAFIA

1. INTRODUZIONE

1.1   I RECETTORI CHINASICI NEGLI ANIMALI E NELLE PIANTE

Le cellule animali e vegetali possono riconoscere moltissimi stimoli differenti, trasdurne l’informazione nelle appropriate componenti cellulari, e rispondere alterando il proprio metabolismo, la crescita e lo sviluppo.

La maggior parte dei segnali sono inizialmente percepiti da recettori trans membrana la maggioranza dei quali funziona mediante l’attivazione di un dominio protein-chinasico intrinseco. Tali recettori sono conosciuti come receptor protein kinases (RPKs) e possono essere suddivisi in due famiglie:

1. Recettori che autofosforilano residui di tirosina

2. Recettori che autofosforilano residui di serina e/o treonina

La maggior parte dei recettori animali finora caratterizzati autofosforilano residui di tirosina con l’eccezione dei 25 membri (si veda la rassegna di Kingsley, 1994) della superfamiglia di recettori TGF-β (tranforming growth factor-β) (Massague, 1990) con attività serina/treonina kinasica dei metazoi. Invece tutti i recettori chinasici vegetali hanno attività serina/treonina chinasica, con la sola eccezione del PRK1 (pollen-expressed receptor-like kinase) che presenta una doppia specificità per serina/treonina e per tirosina (Mu et al., 1994).

A livello strutturale i recettori chinasici che attraversano una sola volta la membrana plasmatica sia nelle piante che negli animali sono costituiti da tre regioni:

1. Dominio extracellulare variabile che presenta una sequenza segnale ammino terminale

2. Dominio transmembrana che attraversa una sola volta il doppio strato fosfolipidico

3. Dominio citoplasmatico carbossi-terminale dotato di attività chinasica (auto fosforilazione di residui di serina/treonina o tirosina) altamente conservato.

Proprio per la loro somiglianza strutturale con le RPKs animali, i recettori chinasici vegetali sono chiamati receptor-like kinases RLKs.

1.2   I RECETTORI SERINA/TREONINA CHINASICI E LA RISPOSTA DELLE PIANTE

La notevole versatilità delle piante deriva sia dal fatto che sono organismi sessili che dall’essere alla base della catena alimentare. Benché siano da tempo note alcune forme di movimento e addirittura di ‘intelligenza’ (Trevawas, 2003) le piante a differenza di molti organismi animali sono sostanzialmente incapaci di spostarsi fisicamente e sfuggire dalle condizioni ambientali sfavorevoli, dall’erbivoria e dai patogeni. Per sopravvivere le piante hanno dovuto evolvere complesse strategie di adattamento e la capacità di reagire il più rapidamente possibile agli stress ambientali. I meccanismi di base che permettono alle cellule di percepire e rispondere all’ambiente circostante, si attuano attraverso la concatenazione di tre eventi:

1. percezione dello stimolo

2. trasferimento e amplificazione del segnale

3. risposta

Uno dei requisiti primari per una risposta rapida alle perturbazioni esterne è l’evoluzione di specifici recettori che legano uno specifico ligando. Ciò implica che ogni ligando sia percepito da uno specifico recettore.

Il passo successivo consiste nel trasdurre il segnale dalla membrana plasmatica al nucleo. Questo si attua grazie ad una rapida successione di reazioni di fosforilazione e defosforilazione di proteine del citoplasma. Le proteine coinvolte nella cascata di segnalazione includono sia chinasi che fosfatasi e sono responsabili di eventi di fosforilazione reversibile.

Il passo finale consiste nella sintesi di un set di proteine specifiche in grado di provocare nella pianta la risposta alla perturbazione e di facilitarne l’adattamento. A livello nucleare si ha l’attivazione di fattori di trascrizione che riconoscono e legano specifici motivi di sequenza localizzati nel promotore di particolari sottoinsiemi di geni (Jenkins, 1999).

Gli stimoli a cui le piante devono essere in grado di rispondere possono derivare sia dall’ambiente circostante che essere generati dallo stesso organismo. I primi comprendono fattori sia biotici che abiotici quali la luce, i patogeni, le ferite, la disponibilità d’acqua e le temperature estreme; i secondi, gli ormoni, gli steroidi e i prodotti del metabolismo primario e secondario della pianta. Essendo l’adattamento agli stress abiotici e biotici avvenuto contemporaneamente nel corso dell’evoluzione, non è sorprendente che la risposta della pianta a differenti tipi di stress si sovrapponga ampiamente. (Fujita et al., 2006; Walley et al., 2007; Torres and Dangl, 2005).

A prescindere dalla natura dello stress, la capacità di percepire sia la presenza di un potenziale patogeno o predatore, sia i cambiamenti delle condizioni ambientali è in larga parte affidata ad un’ampia gamma di recettori, le plant protein serine/threonine kinases. Tali recettori possono essere localizzati sia all’esterno della cellula come parte della membrana plasmatica (Walker, 1994), che all’interno come proteine solubili (Hammond-Kosack and Jones, 1996). Nonostante il legame tra ligando e recettore risulti molto specifico a seconda dello stress e ciascun sottoinsieme di geni attivati sia specifica per un determinato stimolo, gli eventi di segnalazione a valle che si generano all’interno della cellula convergono spesso nelle stesse componenti (Fujita et al., 2006). Differenti stimoli possono condividere in parte l’attivazione degli stessi geni target e quindi sfruttare le principali vie di trasduzione del segnale. Ad esempio, l’attacco di un patogeno comporta l’espressione di pathogenesis related (PR) genes (Blee et al., 2004) che permettono alla pianta di adattarsi alla presenza del patogeno stesso. Tuttavia le proteine PR vengono prodotte anche in risposta ad altri tipi di stress quali l’ozono (Mahalingam et al., 2005; Tosti et al., 2006) dimostrando l’esistenza di un cross talk fra vie di segnalazione differenti.

Negli ultimi anni si stanno delineando sempre più in dettaglio i punti di convergenza fra i diversi tipi di stress (fig. 1.1).

Fig 1.1 Cross talk tra stress biotico e biotico. Tratta da Fujita et al., 2006.

Ad esempio sia i patogeni che i più svariati stress abiotici come erbicidi, fungicidi, ozono, radiazioni UV causano i loro effetti deleteri, direttamente o indirettamente, attraverso l’aumento delle reactive oxygen species (ROS). Sebbene le ROS possono essere formate come prodotti metabolici in seguito a varie situazioni di stress abiotico, le cellule vegetali le producono anche in seguito all’attacco di un patogeno (Apel e Hirt, 2004). L’attivazione della cascata di trasduzione delle MAPKs in seguito alla formazione dei radicali dell’ossigeno è stata considerata una prova del fatto che le ROS agiscono a monte delle MAPKs.

1.3   LE RLKs DELLE PIANTE

1.3.1 L’ ORIGINE E L’ EVOLUZIONE

Negli ultimi anni sono stati identificati nelle piante numerosi geni omologhi a quelli codificanti le RPKs animali e chiamati receptor-like protein kinases (RLKs) per la loro somiglianza strutturale alle RPKs. (da Johnson e Ingram COPB 2005). Nel corso degli ultimi venti anni, da quando cioè il primo recettore RLK, ZmPK1, è stato identificato nel mais (Walker e Zhang 1990), pochi biologi vegetali avrebbero immaginato che le RLKs costituissero la più ampia famiglia genica di recettori nelle piante con oltre 600 membri in Arabidopsis (il 2,5% dei geni codificanti per proteine) e oltre 1100 nel riso (Dardick et al., 2006; Fritz-Laylin et al., 2005; Shiu et al., 2004). Gli attributi strutturali e le possibili origini evolutive del clade RLK sono stati ampiamente investigati (Morillo e Tax, 2006; Shiu e Blecker, 2001a; Shiu e Blecker, 2003;). I dati esistenti e l’analisi filogenetica indicano che nonostante le somiglianze strutturali, le RLK si sono evolute indipendentemente dalle RPKs animali (Shiu e Blecker, 2001a; Cock et al., 2002).

Cock et al. (2002) proposero di suddividere la grande superfamiglia genica dei recettori chinasici delle piante e dei metazoi in 3 grandi gruppi: RTK (receptor tyrosine kinases) e RSK (receptor serine/threonine kinase della famiglia TGFβR) degli animali e PRK (plant receptor kinases) delle piante. Sebbene le PRK delle piante siano filogeneticamente più strettamente imparentate con queste due famiglie di recettori animali di quanto non lo siano con le altre famiglie di chinasi, ciascuna delle tre classi di recettori chinasi rappresenta una famiglia monofiletica distinta. Inoltre, il