Neutralizzazione delle tossine del veleno di Echis carinatus con molecole vegetali contenute nei semi di Mucuna pruriens: un approccio proteomico

Neutralizzazione delle tossine del veleno di Echis carinatus con molecole vegetali contenute nei semi di Mucuna pruriens: un approccio proteomico

Alessio Cortellazzo

Neutralizzazione delle tossine del veleno di Echis carinatus con molecole vegetali contenute nei semi di Mucuna pruriens: un approccio proteomico

Alessio Cortellazzo

Narcissus - Self Publishing made serious

Edizione digitale: aprile 2012

ISBN: 9788863697834

Edizione digitale realizzata da Simplicissimus Book Farm srl

Premessa

Questa tesi rappresenta la continuazione di un lavoro svolto negli anni presso il Dipartimento di Medicina Interna, Scienze Endocrino-Metaboliche e Biochimica, nato anni fa da una collaborazione con il professore John Aguiyi, dell’Università di Jos (Nigeria). E’ importante evidenziare che questa ricerca è iniziata da alcune informazioni, fornite dalla medicina tradizionale nigeriana, inerenti ai semi di Mucuna pruriens che, una volta ingoiati, conferivano una sorta di protezione contro il morso dei serpenti. La cultura africana e la cultura anglosassone, seppur profondamente diverse, confrontandosi hanno dato vita ad una collaborazione che ancora oggi ha dato i suoi frutti, grazie anche all’uso di discipline biochimiche innovative come la Proteomica. I risultati, pubblicati su prestigiose riviste fra cui Proteomics, dimostrano che è importante mantenere vivi la curiosità per la ricerca, il coraggio di conoscere e di dedicarsi a nuovi argomenti.

ABBREVIAZIONI

INDICE

RIASSUNTO

INTRODUZIONE

Piante medicinali e medicina tradizionale

Mucuna pruriens (Mp)

La storia della Mp: dall’Asia all’Africa, fino all’America centrale

Composizione biochimica dei semi

Usi tradizionali dei semi di Mp

Profilo fitochimico di Mp

Fattori nutrizionali

Fattori antinutrizionali/antifisiologici nei semi di Mp

Proprietà medicinali della Mp - Antinutrienti nella salute

Proprietà anti-ossidante della Mp

Attività contro il veleno di serpente

Attività antimicrobica

Serpenti, veleni di serpente e avvelenamento

Composizione del veleno di serpente

Enzimi contenuti nel veleno di serpente attivi sull’emostasi

Veleno della vipera Echis carinatus (EV)

Proteasi presenti in EV

Effetti di EV sull’emostasi e sulla coagulazione

Il proteoma plasmatico umano: substrato modello per lo studio della proteolisi

SCOPO DELLA RICERCA

MATERIALI E METODI

Materiali

Metodi

Preparazione di MPE

Separazione di P e NP

Precipitazione delle proteine

Quantificazione delle proteine

Frazionamento proteico

Cromatografia per affinità con Concanavalina A

Cromatografia in tandem a scambio anionico-cationico

Gel filtrazione

Cromatografia a fase inversa

Estrazione della L-Dopa

TLC

Western blot

MALDI-TOF

Gas-cromatografia

Preparazione del veleno

Preparazione dei globuli rossi e test di emolisi diretto e indiretto

Saggi cromogenici

Zimogramma

SDS-PAGE

Preparazione del plasma e trattamento con EV

2-DE

Analisi statistica e delle immagini

Clotting Time Test

RISULTATI

A. Descrizione strutturale di MPE e relative purificazioni di P ed NP

Caratterizzazione di P

Purificazione di P

Caratterizzazione della frazione NP

B. Proteine di MPE PLA2-simili responsabili della protezione verso EV

Esperimento sulla cross reattività

Identificazione della PLA2 tramite MALDI-TOF

Dosaggio dell’attività PLA2-simile di gpMuc

C. Attività di EV

Attività emolitica

Test di emolisi diretto

Test di emolisi indiretto e neutralizzazione con MPE

Attività proteolitica

Effetto sui substrati cromogenici, sulle caseine, sul fibrinogeno e protrombina

Effetto in vitro di EV sulle proteine plasmatiche: approccio proteomico

a. Plasma intero

b. Plasma depleto

D. Neutralizzazione con MPE dell’attività di EV

Proteomica in vivo con plasma di topo

Clotting Time Test

DISCUSSIONI

CONCLUSIONI

BIBLIOGRAFIA

RIASSUNTO

Mucuna pruriens (Mp) è una pianta medicinale frequentemente utilizzata dalla medicina tradizionale sulla quale sono stati effettuati svariati studi per un suo utilizzo a scopo alimentare, per la sua utilità nel trattamento del morbo di Parkinson e per la capacità dei suoi semi di neutralizzare gli effetti del veleno di Echis carinatus (EV). Proprio da quest’ultima proprietà dei semi di Mp abbiamo sviluppato le nostre ricerche approfondendo la conoscenza sulla composizione dei semi di questa pianta. Le componenti proteiche dei semi sono state studiate con l’analisi proteomica mentre le componenti non proteiche con l’uso di metodi estrattivi e saggi enzimatici. Caratterizzando le componenti dei semi abbiamo orientato le nostre ricerche verso l’identificazione del principio responsabile della protezione verso il morso dei serpenti. Con studi più approfonditi sulla componente proteica, abbiamo dimostrato che la protezione a lungo termine si basa sul meccanismo immunologico dovuto alla stretta somiglianza, strutturale e funzionale, fra una componente proteica (gpMuc) dell’estratto dei semi a la principale tossina (PLA2) contenuta in EV. Analisi approfondite sulle componenti dei semi hanno dimostrato che la neutralizzazione diretta delle tossine di EV può avvenire tramite molecole non proteiche, come L-Dopa, sulla PLA2 stessa o per mezzo di inibitori proteici contro le proteasi contenute in EV. Il veleno di questa vipera è una miscela complessa di tossine che contribuiscono alla sua letalità. Nel presente lavoro, l’attività proteolitica di EV è stata analizzata tramite saggi cromogenici, zimogrammi e SDS-PAGE. Per capire il meccanismo molecolare dell’avvelenamento, abbiamo studiato gli effetti, in vitro, di EV sulle proteine plasmatiche umane. Abbiamo individuato i substrati proteici delle proteasi di EV e i loro frammenti proteolitici. Abbiamo analizzato l’attività proteolitica di EV su proteine standard come la protrombina e il fibrinogeno oltre che sul plasma. Per stabilire le condizioni di analisi ottimali tra EV e le proteine plasmatiche, il plasma è stato incubato con EV (plasma trattato), depleto dalle proteine più abbondanti e sottoposto ad SDS-PAGE. I campioni dal plasma controllo e trattato sono stati inoltre analizzati con 2-DE/MALDI-TOF MS che ci ha portato all’identificazione di quattro classi di proteine plasmatiche che vengono proteolizzate da EV: proteasi, inibitori delle proteasi, proteine di legame e trasportatori. Abbiamo constatato che EV proteolizza le proteine intere ma anche i frammenti fisiologici. Inoltre, attraverso ulteriori analisi proteomiche, abbiamo testato, in vivo, l’efficacia dell’estratto acquoso dei semi di Mucuna pruriens (MPE) contro EV. Abbiamo studiato i cambiamenti nel proteoma plasmatico dovuti al trattamento con MPE e identificato le proteine responsabili della sopravvivenza del gruppo dei topi (CHALLENGED) trattati con MPE ed EV. Abbiamo studiato sei diversi gruppi: tre gruppi controllo (un trattamento con soluzione salina, un trattamento breve con MPE e un trattamento lungo con MPE); un gruppo trattato solo con EV; due gruppi trattati (un trattamento